Posted in مقالات و پایان نامه ها

کسب درآمد اینترنتی از طریق فروش فایل

کسب درآمد از اینترنت برای چه کسانی مناسب است؟

می‌خواهید درآمد اینترنتی داشته باشید؟ دوست دارید در خانه خودتان کسب درآمد کنید؟ به طور کلی کسب درآمد از اینترنت را به افراد زیر پیشنهاد می کنیم:

  • دانشجویان
  • خانه داران
  • دانش آموزان و نوجوانان
  • کارمندانی که به دنبال کار پاره وقت برای پوشش هزینه های زندگی هستند.
  • معلمان و مدرسان.
  • افراد جویای کار در منزل.
  • و خلاصه همه علاقمندان به کسب درآمد از اینترنت

هر فایل  و تحقیق و پروژه ای که قابل دانلود باشد قابل فروش هم هست. با وب سایت فایل آماده درآمد شغلی خود را متحول کنید و با استفاده از  ساخت فروشگاه اختصاصی خود که امکان فروش فایل ها را دارا می باشد، محصولات دانلودی، تحقیقات و پروژه های دانشگاهی و دانش آموزی و صنعتی خود را راه اندازی کنید.

کسب درآمد اینترنتی با فایل آماده

افرادی که یک کالای فیزیکی تولید می کنند، تقریبا تکلیف آنها جهت فروش محصولات مشخص است؛ یا یک پخش کننده پیدا می کنند یا محصولات خود را به صورت آنلاین به فروش می رسانند تا به دست مشتری برسد ولی اگر بخواهید همین کار را برای محصولات دانلودی از قبیل تحقیق ، پروژه و یا هر کالای دیجیتال دیگری که ماهیت فیزیکی ندارد انجام بدهید، تکلیف چیست؟

http://fileamadeh.com/wp-content/uploads/2019/01/479921-PGQPM6-946.png

حالا وقتشه از خدمات و امکاناتی که وب سایت فایل آماده به آدرس www.Fileamadeh.com  تحت اختیارتون میزاره استفاده کنید. این سایت یک فضا و زیرساختی را برای خرید و فروش محصولات قابل دانلود از قبیل پروژه و تحقیق دانشگاهی از قبیل پایان نامه ، گزارش کارآموزی ، تحقیق درسی ، کتاب و جزوه در اختیاز شما قرار می دهد  که با ثبت نام در آن می توانید یک فروشگاه رایگان فایل و محصولات دانلودی داشته باشید.

همچنین شما میتوانید علاوه بر فروش محصولات اختصاصی خود، سایر محصولات موجود در سیستم را نیز به فروش رسانده و با استفاده از سیستم همکاری در فروش، کسب در آمد نمایید.

وب سایت فایل آماده به چه نحوی کار میکند؟

وب سایت فایل آماده پلتفرمی کارآمد و کاربر پسند را جهت خرید و فروش فایل قابلیت ایجاد یک فروشگاه کاملا رایگان برای شما فراهم کرده است. وب سایت فایل آماده آسان‌ترین و ارزان‌ترین روش خرید و فروش انواع فایل ها را در فضای مجازی برای شما فراهم نموده است.

چگونه با فایل آماده در اینترنت کسب درآمد کنیم؟

شما از دو طریق می توانید در اینترنت کسب درآمد داشته باشید که در زیر به هر دو روش کسب درآمد از وب سایت فایل آماده اشاره خواهیم نمود:

روش اول از کسب درآمد اینترنتی:

شما می توانید به راحتی نتایج تحقیقات و پروژه های خود را که چه در زمان دانشجویی و یا چه در هنگام کار خود آماده کرده اید و یا فایل تحقیق زمان دانشجویی خود را در وب سایت فایل آماده آپلود کنید:

فایل های دیجیتالی خود از قبیل کتاب الکترونیکی ، مقاله ، پایان نامه ، گزارش کارآموزی ، تحقیق دانشگاهی ، تحقیق دانش آموزی و … را در سیستم آپلود نمایید. شما می توانید هر فرمتی را تا حجم نا محدود به ازای هر فایل در سیستم بارگذاری کنید.

بعد از ثبت نام و آپلود فایل های خود شروع به فروش کنید:  با عضویت در وب سایت فایل آماده شما یک فروشگاه رایگان فروش محصولات دانلودی خواهید داشت. هر محصولی که آپلود کنید در فروشگاه شما و در فروشگاه اصلی فایل آماده جهت فروش به نمایش گذاشته می شود.

پس از هر بار فروش شما می توانید درخواست وجه خود را در پنل اختصاصی خود درج نمایید تا سهم فروش شما به حساب بانکی شما واریز گردد.

روش دوم از کسب درآمد اینترنتی:

اگر شما به هر دلیلی فایل قابل فروش نداشته باشید می توانید از امکاناتی که وب سایت فایل آماده در قالب سیستم همکاری در فروش محصولات دانلودی ایجاد نموده است بهره مند شوید. فایل آماده یکی از بهترین و اصولی‌ترین سایت‌های همکاری در فروش است که شما از طریق آن میتوانید اقدام به ثبت نام و کسب درآمد کنید.

در صورتی که شما هیچ فایلی برای فروش ندارید پیشنهاد می شود در سامانه فروش محصولات دانلودی فایل آماده ثبت نام و نسبت به ایجاد یک فروشگاه رایگان اقدام نمایید تا بتوانید با استفاده از سیستم همکاری در فروش، از طریق فروش فایل های دیگر فروشگاه ها و سایر محصولات دانلودی موجود در سایت، کسب درآمد نمایید. همچنین در صورتی که دارای وبلاگ یا وبسایتی هستید می توانید از طریق قرار دادن کدهای بازاریابی در وبلاگ یا وبسایت خود، بدون هیچگونه سرمایه گذاری، به درآمد بالایی برسید.

فروشگاه ساز رایگان و ایجاد فروشگاه رایگان فایل

در صورتی که شما فایلی را جهت فروش داشته باشید، با استفاده از این روش میتوانید پس از ثبت نام، نسبت به قراردادن فایل در وب سایت فایل آماده اقدام نمایید. فایل شما ابتدا توسط تیم فنی و همکاران ما در وب سایت فایل آماده  بررسی شده و در صورت تأیید، در سایت قرار خواهد گرفت و شما به عنوان مالک، در ازای هر فروش از فایل مذکور که توسط بازاریابان انجام گیرد صاحب سهم فروش خواهید شد.

طریقه کسب درآمد از فروش فایل

هر شخص، دانشجو یا متخصصی در طی دوران تحصیل و کار، حجم زیادی فایل آماده در اختیار دارد که در اکثر مواقع این فایل ها پس طی دوره ی مذکور، بلا استفاده خواهند بود درحالی که مورد نیاز دیگران هستند؛ اینها می تواند شامل پایان نامه ، گزارش کارآموزی ، تحقیق ، جزوات ، نمونه های اجرایی و ده‌ها نوع فایل قابل دانلود دیگر باشد، واگذاری و فروش این فایل‌ها به دیگران یک منبع درآمد اینترنتی پایدار و سالم است.

امکاناتی که وب سایت فایل آماده تحت اختیار فروشندگان قرار می دهد

۱. ارائه فروشگاه رایگان فروش فایل

۲. امکان اتصال به دامنه یا ساب دامنه شخصی

۳. پرداخت کارمزد فقط به ازای فروش

۴. سیستم بازاریابی و جذب همکار فروش

۵. امکان تخصیص کد تخفیف و مالیات

۶. کسب درآمد حتی بدون داشتن فایل

۷. رمزنگاری تمامی فایل های آپلود شده

۸. تخصیص درگاه پرداخت اینترنتی

۹. ارتباط مستقیم با تمامی مشتریان

۱۰. مجهز به سیستم اطلاع رسانی پیامکی

۱۱. طراحی واکنش گرا و Mobile Friendly

۱۲. مجهز به سیستم آنالیز حرفه ای فروش و مشتریان

Posted in مقالات و پایان نامه ها

روش مطالعه زیست کنکور

برای موفقیت در زیست کنکور یک فرمول کلی برای شما عزیزان درست کردم. فرمولی بسیار ساده ولی در عین حال کاربردی!
برای موفقیت در این درس مهم کافی است مراحل زیر را به ترتیب انجام دهید:

  1. یادگیری و درک مفاهیم زیست
  2. مطالعه دقیق کتاب درسی زیست
  3. مطالعه دقیق درسنامه کتاب کمک‌آموزشی معتبر
  4. یادگیری تست زنی زیست
  5. حل تست‌ توسط خود شما
  6. شرکت در آزمون‌های آزمایشی
  7. تسلط

حال به ترتیب این گام‌ها را بررسی کنیم:

گام اول: یادگیری و درک مفاهیم زیست:

زیست کنکور مفهومیاین گام، اولین و مهمترین گام آموزش شماست. تا زمانی که به درک عمیقی از زیست کنکور نرسید، به هیچ وجه نمی‌توانید در سایر مراحل دیگر مانند تست‌زنی و … موفق شوید. حال سوالی که پیش می‌آید این است که چگونه به درک درستی از زیست کنکور برسیم؟

برای رسیدن به این هدف راه‌های مختلفی وجود دارد:

  • شرکت در در کلاس­های حضوری که اگر مدرس شما تراز اول باشد بهترین روش و البته گرانترین روش است. اگر در شهرهای کوچک زندگی می­کنید ممکن است به دبیران درجه یک دسترسی نداشته باشید.
  • با تلاش خودتان در خانه می­توانید این درس را بخوانید ولی وقت بسیار زیادی از شما تلف خواهد شد و خیلی از مواقع به درک اشتباهی از مطالب می­رسید مخصوصا کسانی که فارغ­ التحصیل رشته­ های غیرتجربی هستند و پس زمینه ­ای از درس زیست شناسی ندارند. بارها این موضوع را تجربه کرده­اید که بعد از تدریس یک درس توسط استاد، یادگیری آن در خانه چقدر ساده­ تر و سریع­تر خواهد شد.
  • استفاده از فیلم‌های آموزشی مفهومی: این روش شاید کم هزینه‌ترین و پربازده‌ترین روش باشد به شرط آنکه از فیلم‌های آموزشی باکیفیت و مناسب استفاده کنید. یک مزیت مهم این روش این است که وقت شما در رفت و آمد بین کلاس‌ها تلف نمی‌شود و حتی می‌توانید در اوقات پرت خود مانند زمانی که در مترو یا تاکسی هستید هم زیست را فرابگیرید. بسیاری از موسسات مفهوم و حل تست را به صورت مخلوط تدریس می‌کنند که از دید من روش صحیحی نیست. دلیل آن هم این است که ذهن انسان مانند یک قفسه است و اگر مطالب دسته‌بندی شده و به ترتیب در آن جای گیرد بازدهیادگیری شما بسیار افزایش پیدا خواهد کرد.

گام دوم: مطالعه دقیق کتاب درسی زیست

در این مرحله شما باید همان مفاهیم را با دقت از روی متن کتاب مطالعه کنید که می‌تواند به شکل‌های مختلف باشد. اولین گام، مطالعه دقیق و خط به خط کتاب درسی است. در مرحله دوم از درسنامه یک کمک آموزشی مناسب استفاده کنید.

گام سوم: مطالعه درسنامه کتاب کمک‌آموزشی

برای فراگیری نکات تکمیلی و توجه بیشتر به جزییات حتما باید از یک درسنامه کتاب کمک‌آموزشی استفاده کنید. یادمان باشد که معلم و یا فیلم مفهومی جزییات ریز را به ما آموزش نمی‌دهد، در غیر این صورت تدریس بسیار طولانی و کسل‌کننده خواهد شد.

توصیه می‌کنم از جزوه استفاده نکنید. دلیل آن را در ادامه مقاله خواهم گفت. این که از چه کتاب کمک‌آموزشی‌ای استفاده کنید هم در ادامه مقاله خواهم گفت.

گام چهارم: یادگیری تست‌زنی زیست

 

تست زیست کنکورتا قبل از این مرحله شما در حد امتحان نهایی موفق خواهید بود ولی برای زیست کنکور باید مهارت‌های بیشتری را کسب کنید. یکی از مهمترین مهارت‌ها تست زنی است. اما تست زنی را چگونه یاد بگیریم؟

راه اول آزمون و خطاست. یعنی انقدر تست بزنیم تا تا قلق آن را یاد بگیریم. مسلما این روش دو عیب بزرگ دارد؛ یکی اینکه زمان زیادی از ما تلف می‌شود و دوم اینکه ممکن است تمام مهارت‌ها نتوانیم با تجربه به دست آوریم.

راه دوم شرکت در کلاس‌های نکته تست است که یک استاد ماهر به شما راه‌های تست زنی را آموزش می‌دهد. توجه داشته باشید که ترجیحا خود استاد بهتر است رتبه برتر کنکور باشد زیرا مطمئن خواهید شد که در عمل هم تست‌زن ماهری است. اگر استاد شما تراز اول باشد، این روش بهترین و البته گرانترین روش است.

راه سوم تماشای فیلم‌های حل تست است. این روش شاید کم هزینه‌ترین و پربازده‌ترین روش باشد به شرط آنکه از فیلم‌های آموزشی باکیفیت و مناسب استفاده کنید. یک مزیت مهم این روش این است که وقت شما در رفت و آمد بین کلاس‌ها تلف نمی‌شود و حتی می‌توانید در اوقات پرت خود مانند زمانی که در مترو یا تاکسی هستید هم زیست را فرابگیرید.

 

منبع:

روش مطالعه زیست کنکور

Posted in مقالات و پایان نامه ها

تکنولوژی دستگاه‌ های فلزیاب طلا یاب گنج‌ یاب

تکنولوژی دستگاه‌ های فلزیاب طلا یاب گنج‌ یاب

تکنولوژی دستگاه‌ های فلزیاب طلا یاب گنج‌ یاب

احتمالا بار ها در مورد دستگاه های فلزیاب، گنج یاب و دستگاه طلایاب مطالب زیادی را شنیده اید و حداقل نحوه کار آن ها را می دانید. اما بسیار مهم است که بدانید فلزیاب ها اساسا با طلایاب ها تفاوت دارند.

تفاوت اصلی در نوع کارکرد آن ها است و این که برای چه اهدافی استفاده می شوند. تکنولوژی گسترده ای از این دستگاه ها در ایستگاه های بازرسی پلیس و فرودگاه ها به کار گرفته می شود که قطعا صرفا طلایاب نیستند.

طلایاب ها برای استخراج معادن و همین طور یافتن فلزات غیر  آهنی استفاده می شوند و میدان مغناطیسی آن ها بر اساس یافتن مواردی چون طلا، قلع، مس و پلاتین استفاده می شود و کاملا هم تجاری بوده و از نوع نیمه خودکار و سنگین و … آن را می توانید در بازار بیابید.

خرید و انتخاب دستگاه فلزیاب و طلایاب چگونه است

این دستگاه ها توسط برخی شرکت ها برای مصارف شخصی به فروش می رسند و نمونه های دیگر باید به شیوه های متفاوت خریداری شوند.

مارک های متنوعی در دنیا و بخصوص اروپا، ژاپن و چین این دستگاه ها را طراحی و مهندسی خواهند کرد. بسته به امکانات و برخی تفاوت ها قیمت این دستگاه های مدرن دچار تغییراتی می شوند.

احتمالا شما هم مانند بسیاری دیگر، مدل های عصا مانند، را مشاهده کرده اید که با کنترل دست و حرکت یک میدان مغناطیسی دایره ای شکل و حرکت بر روی زمین کار می کنند.

تکنولوژی دستگاه‌ های فلزیاب طلا یاب گنج‌ یاب

نحوه تشخیص نوع فلزات در زیرزمین توسط فلزیاب ها

هر کدام از فلزات فاز مغناطیسی متفاوتی را به دستگاه ها القا می کنند و فلزیاب ها از این روش می توانند تشخیص دهند که کدام فلز در خاک و چه عمقی از آن نهفته است (بررسی میزان عمق نیز بر اساس همین فاصله ارسال سنجیده می شوند که در برخی از دستگاه های ضعیف تر این امکان وجود ندارد).

در واقع این اختلاف شنیداری موجود در خاصیت القای این دستگاه ها است که در نهایت به صدا های بوق ممتد بدل شده و به شما اطلاع می دهد که دستگاه فلزی را یافته است.

انتخاب بهترین گزینه فلزیاب مرتبط با فعالیت مشتری

حال اگر کسی قصد خرید و یا تهیه یکی از این دستگاه ها را داشته باشد قطعا در بازار ایران با مشکل مواجه خواهد شد، نخست این که برند های فعال در این حوزه بی شمار بوده و از کشور های زیادی هستند.

از یک سوی دیگر ممکن است اطلاعات کافی را برای انتخاب تکنولوژی دستگاه (فرکانس پایین، القا یا همان پالس و نوسان ساز یک نواخت) نداشته باشید. پس قطعا تهیه آن از یک مرکز معتبر با فعالیت چندین ساله بهترین راه است.

تکنولوژی دستگاه‌ های فلزیاب طلا یاب گنج‌ یاب

تشخیص نوع دستگاه طلایاب با توجه به زمین و خاک

شما باید بسته به زمین و خاکی که می خواهید فعالیت خود را بر روی آن انجام دهید این دستگاه را انتخاب کنید و جالب است بدانید در زمین های خیس و مرطوب دستگاه های حتی ضعیف امکانات خوبی را ارائه می دهند و کافی هستند.

عموما به دلیل تشخیص مناسب فلز از دستگاه های با ویژگی Just Gold استفاده می شود که قیمت بالایی دارند.

شرکت فلزیاب پرشین شما را در انتخاب بهترین دستگاه فلزیاب مورد نظر شما راهنمایی خواهد کرد.

تلفن های مشاوره و فروش فلزیاب

09124555154

09124551985

09124554860

09128558589

09128554269

09120946049

09182946488

09182578019

09162422505

09130246274

09114332382

09114332384

www.felezyabpersian.com

 

 

Posted in پایان نامه ها

منبع پایان نامه ارشد درمورد 95/24، 07/30،

R
9a
92/31
S
56/29
S
0
R
0
R
0
R
0
R
29/17
I
37/39
S
04/38
S
31/33
S
03/19
S
0
R
56/27
S
94/31
S
83/13
R
42/12
R
42/12
R
61/28
S
46/28
S
54/33
S
0
R
9b2
94/27
S
37/36
S
0
R
0
R
0
R
0
R
0
R
93/29
S
11/28
S
17/28
S
52/20
S
0
R
13/32
S
63/36
S
66/18
S
30
S
25
S
47/20
I
18
R
63/23 S
0
R
10d2
78/45
S
69/41
S
0
R
0
R
0
R
0
R
34/35
66/55
S
73/37
S
84/40
S
74/23
S
0
R
25/39
S
26/57
S
45/28
S
43/33
S
79/49
S
46/40
I
72/35
S
22/50
S
0
R
5b
53/34
S
18/31
S
0
R
0
R
0
R
0
R
48/20
S
70/39
S
40/27
S
29/38
S
66/24
S
0
R
19/35
S
68/35
S
68/35
S
42/28
S
77/38
S
77/38
S

77/13
R
38/24
S
0
R
5e
31/36
s
65/27
S
0
R
0
R
0
R
0
R
59/15
I
23/29
S
54/22
S
61/33
S
33/20
S
0
R
18/29
S
52/30
S
11
R
75/19
R
47/25
S
82/25
S
61/23
S
19/18
I
0
R
6a
62/16
R
21
R
0
R
0
R
0
R
93/11
R
93/10
R
66/14
S
0
R
84/14
R
13/23
S
06/18
I
83/24
S
05/25
S
15/11
R
20/15
R
82/17
I
51/23
S
30/18
S
35/13
I
0
R
7c
23/32
S
99/33
S
0
R
0
R
0
R
0
R
45/19
S
18/37
S
77/31
S
80/32
S
93/32
S
0
R
69/36
S
16/36
S
23/19
S
65/22
S
12/35
S
43/37
S
99/19
S
10/23
S
14/12
R
12c
35/44
S
97/27
S
0
R
14/19
S
0
R
0
R
77/18
S
17/33
S
30/24
S
44/40
S
07/30
S
0
R
52/32
S
13/21
S
89/16
R
36/27
S
06/28
S
52/30
S
07/34
S
22/31
S
92/13
R
10d1
54/31
S
54/39
S
0
R
07/11
I
0
R
0
R
07/24
S
85/32
S
01/28
S
89/35
S
13/24
S
0
R
88/34
S
04/39
S
26/17
S
09/18
R
40/25
S
56/34
S
08/12
R
40/25
S
49/13
R
B2
10/31
S
27/31
S
0
R
0
R
0
R
0
R
97/17
I
47/38
S
35/39
S
01/32
S
02/32
S
0
R
22/32
S
88/36
S
26/18
S
49/22
S
86/24
S
93/38
S
62/10
R
91/19
I
09/12
R
1c
71/53
S
12/35
S
0
R
0
R
0
R
0
R
45/20
S
03/43
S
20/29
S
95/50
S
79/26
S
0
R
46/40
S
38/43
S
47/16
R
38/29
S
42/25
S
04/37
S
61/23
S
16/33
S
0
R
G8
83/46
S
85/34
S
0
R
0
R
0
R
0
R
50/18
S
49/34
S
82/26
S
48/43
S
82/23
S
0
R
36/36
S
94/36
S
46/13
R
64/34
S
37/39
S
77/29
S
83/29
S
07/30

0
R
H4
06/35
S
24/31
S
0
R
0
R
0
R
0
R
82/21
S
05/28
S
03/25
S
19/32
S
80/19
S
0
R
81/30
S
34
S
82/14
R
40/17
S
85/25
S
73/31
S
0
R
0
R
0
R
H4a
57/21
S
14/30
S
22/12
I
59/11
I
0
R
0
R
06/24
S
56/40
S
73/28
S
53/31
S
85/24
S
0
R
42/35
S
61/34
S
32/14
R
14/25
S
70/39
S
32
S
19/13
R
72/34

14/12
R
12D
50/10
R
75/20
S
22/21
I
0
R
0
R
0
R
0
R
95/24
S
0
R
85/13
R
95/24
S
0
R
36/17
R
0
R
0
R
19
R
0
R
57/17
I
0
R
66/16

0
R
2b
11/43
S
27/31
S
0
R
0
R
0
R
0
R
09/18
S
89/31
S
79/23
S
51/40
S
82/20
S
0
R
60/28
S
55/29
S
28/13
R
48/28
S
99/27
S
76/26
S
76/24
S

61/19

0
R
6a
68/26
S
44/25
S
0
R
0
R
0
R
80/14
R
65/11
R
28/25
S
0
R
13/28
S
46/23
S
10/15
I
58/24
S
25/24
S
63/11
R
95/23
S
44/23
S
51/22
S
28/16
R
07/19

0
R
6b
32/29
S
95/28
S
0
R
0
R
0
R
0
R
0
R
52/33
S
0
R
92/28
S
04/33
S
0
R
95/24
S
96/25
S
07/12
R
34/31
S
60/19
I
54/25
S
60/15
R
67/18

0
R
TKCH
مات
68/14
R
86/25
S
11/25
S
0
R
0
R
0
R
0
R
42/20
S
0
R
35/20
R
0
R
0
R
56/18
I
39/23
S
41/13
R
79/16
R
07/27
S
73/22
S
0
R
12/26

08/11
R
TSD
مات
0
R
35/27
S
0
R
0
R
0
R
0
R
0
R
42/30
S
0
R
63/25
S
54/36
S
0

Posted in پایان نامه ها

منبع پایان نامه ارشد درمورد سه مرحله ای، بیوتکنولوژی

حساسیت نسبت به آنتی بیوتیک
در این مطالعه تعیین حساسیت نسبت به 22 گروه آنتی بیوتیک شامل پنی سیلین ها، سفالوسپورین ها، آمینوگلیکوزید ها، گلیکوپپتید ها، ماکرولیدها، لینکوزامیدها، تتراسایکلین ها، کینولون ها و دیگر آنتی بیوتیک ها نظیر کلرامفنیکل، نیتروفورانتوئین، کوتریماکسازول و میتومایسینC با استفاده از روش دیسک دیفیوژن نسبت به این آنتی بیوتیک ها انجام گردید. در این روش از معیارهای CLSI استفاده شده است
جدول 3-3- دیسک های انتی بیوتیک مورد استفاده جهت آنتی بیوگرام در این مطالعه
K- 30µg
TOB- 10µg
GM- 10µg
S- 10µg
کانامایسین
توبرامایسین
جنتامایسین
استرپتومایسین
آمینوگلیکوزید ها

CF- 30µg

CRO- 30µg
Ctx-30µg
سفالوتین : نسل اول

سفتریاکسون، سفوتاکسیم :نسل سوم

سفالوسپورین ها
V- 30µg
ونکومایسین

گلیکوپپتیدها
CC- 2µg
کلیندامایسین

لینکوزامید ها
E- 15µg
اریترومایسین
ماکرولیدها
AM- 10µg
P- 10µg
ME- 5µg
OX- 1µg
آمپی سیلین
پنی سیلین
متی سیلین
اگزاسیلین
پنی سیلین ها
CP- 5µg
NA-30µg
OFX-5µg
سیپروفلوکساسین
نالیدیکسیک اسید
آفلوکساسین
کینولون ها
SXT-1.25/23.75µg

کوتریماکسازول
سولفانامید ها
TE-30µg
تتراسایکلین

تتراسایکلین ها
C-30µg
MTC-5µl
FM-300µg
کلرامفنیکل
میتومایسین C
نیتروفورانتوئین
دیگر انتی بیوتیک ها

3-7-1- آزمایش تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش انتشار دیسک در آگار (دیسک دیفیوژن)
ازمایش دیسک دیفیوژن که روش کربی بائر نیز نامیده می شود، از سال 1996 در آزمایشگاه ها به طور وسیعی مورد استفاده قرار گرفت. اغلب آزمایشگاه ها برای تعیین حساسیت انتی بوتیکی از این روش و بر طبق استانداردهای CLSI استفاده می کنند. عوامل اصلی این ازمایش عبارتند از: دیسک های حاوی آنتی بیوتیک، محیط کشت مناسب و سوسپانسیون باکتریایی که هر یک بایستی مطابق استاندارد های CLSI فراهم شوند. (8)
3-7-2-1- روش انجام آزمایش دیسک گذاری
3-7-2-1-1- تهیه محیط کشت
در این آزمون از محیط کشت MRS آگار برای سویه های لاکتوباسیل استفاده شد. این محیط ها بر اساس دستور کارخانه سازنده تهیه و PH آن کنترل می شود. سپس محیط اتوکلاو واستریل می شود و در پلیت ها ریخته شده و صبر می کنیم تا پلیت ها خنک شده و این محیط ها تا یک هفته در یخچال قابل نگه داری هستند. برای کنترل الودگی برخی از این پلیت ها به طور تصادفی جدا و به مدت 24 ساعت در 37-35 درجه سانتی گراد انکوبه شدند.(8)
3-7-2-1-2- روش کار
ابتدا یک کشت تازه 18-24 ساعته برای تمامی سویه ها جمع آوری شده تهیه شد سپس سوسپانسیون میکروبی معادل نیم مک فارلند ساخته شد. سپس یک درصد محیط کشت داخل پلیت سوسپانسیون میکروبی را با سمپلر برداشته و داخل پلیت ریخته سپس با سواپ استریل روی سطح محیط MRS آگار کشت داده ( به صورت سه مرحله ای) و بعد از گذشت 15 دقیقه از تلقیح، دیسک های آنتی بیوتیک را روی آن قرار داده می شوند. لازم به ذکر است که دیسک ها یک ساعت قبل از استفاده بایستی در دمای اتاق قرار گیرند. بعد از گذشت 15 دقیقه از قرار دادن دیسک ها ، پلیت ها درون جار بی هوازی در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 24-18 ساعت انکوبه گردیدند. قطر هاله ها با کولیس اندازه گیری و تفسیر آن با توجه به جدول CLSI انجام می گیرد. ما در این مطالعه به بررسی حساسیت و مقاومت سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به آنتی بیوتیک میتومایسینC پرداختیم بدین صورت که محلولی با غلظت 2/0 میکروگرم بر میلی لیتر تهیه کرده و 5 میکرولیتر از این محلول را در کنار بقیه دیسک های آنتی بیوتیک قرار داده و قطر هاله های آن را نیز با کولیس اندازه گیری کرده ایم.

شکل3-2 – اندازه گیری هاله های عدم رشد

فصل چهارم
نتایج

4-1- شرح مختصری از مطالعه
در این پژوهش به بررسی میزان فاژهای لاکتوباسیل و مقایسه ی 3 روش مختلف، روش دولایه ای آگار، القاء با اشعه ی UV و آزمون هیپ و لورنس برای جداسازی فاژها پرداخته می شود. پروفایل حساسیت آنتی بیوتیک باکتری های اسید لاکتیک در بسیاری از کشورها ثبت شده است.(46 ، 17، 5) لذا در این مطالعه به بررسی پروفایل حساسیت آنتی بیوتیک سویه های لاکتوباسیل جمع آوری شده بر روی 22 گروه مختلف آنتی بیوتیک متشکل از آمینوگلیکوزیدها ( کانامایسین، توبرامایسین، جنتامایسین، استرپتومایسین)، سفالوسپورین ها ( سفالوتین: نسل اول، سفتریاکسون و سفاتوکسیم: نسل سوم)، گلیکوپپتید ها (ونکومایسین)، لینکوزامید ها (کلیندامایسین) ، ماکرولیدها (اریترومایسین)، پنی سیلین ها ( آمپی سیلین، پنی سیلین، اگزاسیلین، متی سیلین) کینولون ها ( سیپروفلوکساسین، آفلوکساسین، نلیدیگسیک اسید )، سولفانامید ها (کوتریماکسازول) ، تتراسایکلین و دیگر آنتی بیوتیک ها که شامل کلرامفنیکل، نیتروفورانتوئین و میتومایسین C پرداخته شد.
4-2- نتایج
سویه های لاکتوباسیل جداسازی شده از مناطق مختلف جغرافیایی ایران موجود در سازمان پژوهش های علمی و صنعتی ایران (گروه بیوتکنولوژی) نگه داری شده است مورد استفاده قرار گرفت.

4-2-1- نتایج حضور یا عدم حضور فاژ در سویه ها
جدول 4-1- نتایج حضور یا فقدان فاژ در سویه ها با استفاده از 3 روش مختلف
PH بعد از 24 ساعت
PH بعد از 7:30 دقیقه
UV
MTC
سویه ها
4/58
5/35

(
12C
3/53
6/02

(
10d2
3/76
5/88

(
7C
4/73
6/15

(
6a
5
5/82


12d
3/61
5/38

(
10d1
6/30
6/28

(
6b
3/67
6/02

(
G8
3/68
5/92

(
5b
3/64
5/48

(
H2b
3/66
5/66

(
H4a
3/65
5/07
(
(
H4
4/73
5/49

(
1C
5
6/31

(
b2
6/22
6/24

(
مات Tkch
4/73
5/49

(
مات TSD
6/37
6/52

(
مات TLD
5/96
6/56

(
مات TLch
4/54
6/14

(
سفید TSD
6/24
6/12


نمدی TLY
4/85
5/77


خامه ای TShs21
4/56
6/14

(
سفید Thch
5/33
6/17

(
سفید Tlch
6/49
6/50

(
مات Tlch1
6/34
6/46

(
مات Tlch2
6/43
6/56

(
مات Tlch3
4/83
5/80


سفید TLD
5/01
6/14

(
TLD1
5/70
6

(
TLD2
5/16
6/28

(
TLD3
5/78
6/04

(
7-1
6/16
6/27

(
11-3
4/62
5/80


12-1
5/13
5/75


8-1
5/58
6/01

(
7-4
5/58
5/97


11-1-1
5/63
5/97

(
5-2
6/39
5/45
(
(
22a
4/04
5/64
(
(
9b1
4/17
6/17


22c
4/60
5/92


2-1
4/71
5/49
(
(
12b
5/68
5/95

(
11-1
4/02
5/81
(
(
22b
3/83
5/65

(
1b
5/74
5/97


11-2
5/88
5/90


کوکسی 10b1
4/95
5/95


باسیل 10b1
3/69
5/47
(
(
9a
3/75
5/42


2a
6/48
6/56

(
ASRV-1
5/40
5/65

(
ASR4
6/48
6/56

(
ASR7-1
3/57
5/75
(
(
10C
6/12
6/38
(
(
ASR1-2
5/11
5/83

(
ASR8-1
6/18
6//46
(
(
ASRS
6/47
6/48

(
AS10
6/43
6/54

(
AS10Z
6/36
6/51


ASR3
5/46
6/27
(
(
ASR1-1
6/30
6/35

(
ASR1
6/41
6/51

(
3-1
3/57
6/33

(
9b2
(( ) نشاندهنده ی مشاهده ی پلاک بااستفاده از روش ذکر شده، (- ) نشاندهنده ی عدم مشاهده پلاک
با توجه به جدول 4-1 که نشاندهنده ی وجود فاژهای لاکتوباسیل است می توان دید که از 65 سویه ی لاکتوباسیلوس با استفاده از روش دولایه ای پلاک 50 سویه، با القاء سویه ها توسط پرتویUV 10 سویه و با استفاده از آزمون Heap and Lawerence 34 سویه دارای فاژ هستند (لازم به ذکر است که PH اولیه شیر 56/6 می باشد). همانطور که در این جدول مشاهده می شود با القاء سویه ها توسط میتومایسین C تمام سویه هایی که دارای فاژ هستند با تولید پلاک قابل تشخیص هستند و تعداد کمی از سویه های دارای فاژ توسط القاء با نمایان شده اند و با القاء توسط حرارت در روش Heap and Lawerence 34 نمونه دارای فاژ هستند چون حرارت یک شوک ضعیف برای القاء فاژ می باشد و این امکان وجود دارد که تمام فاژها القاء نشوند.
4-1- نمودار نتایج مقایسه ی 3 روش مختلف برای جداسازی فاژ

4-2-2- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء UVو میتومایسینC
همانطور که در جدول 4-1 نشان داده شده است 10 سویه مشترک هستند که از هر دو روش القاء با میتومایسین (روش دو لایه ای پلاک ) و القاء با UV جداسازی شده اند، که حدود 38/15 % می باشد.
4-2-3- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء با میتومایسین C (روش دو لایه ای پلاک) و Heap and Lawerence
طبق جدول 4-1 سویه های مشترکی که از روش دو لایه ای پلاک و هیپ و لورنس جدا سازی شده 32 سویه 76/50% می باشد. اشتراک این دو روش از سایر روش ها بیشتر می باشد.
4-2-4- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء با UV و Heap and Lawerence
سویه های مشترکی که از روش القاء با UV و هیپ و لورنس جداسازی شده است 4 فاژ (15/6 %) می باشد.
4-3- نتایج حساسیت و مقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل ها
قطر هاله عدم رشد و مقایسه ی الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل ها در جدول 4-2 نشان داده شده است.

آنتی بیوتیک
ME
C
SXT
K
NA
OFX
S
AM
V
P
CC
CP
TE
FM
GM
CF
CTX
E
OX
CRO
TOB
سویه ها

5-2
68/20 S
20/28
S
0
R
0
R
0
R
0
R
0
R
97/37
S
20/18
S
30/21
I
07/9
R
84/13
I
49/32
S
32/27
S
0
R
75/28
S
69/26
S
0
R
18/22
S
26
S
0
R
22a
45/16
R
31/26
S
44/24
S
0
R
0
R
0
R
72/14
R
80/30
S
0
R
88/18
R
44/24
S
0
R
13/19
I
10
R
67/10
R
90/22
S
43/24
S
63/17
I
05/14
R
18/20
I
0
R
22c
0
R
49/25
S
13/21
S
0
R
0
R
0
R
66/16
I
25/32
S
0
R
20/14
R
68/20
S
0
R
86/21
S
24/9
R
50/10
R
32/24
S
64/25
S
66/18
I
0
R
99/26
S
.
R
2-1
75/20
S
77/26
S
34/17
I
0
R
0
R
43/12
R
0
R
25/27
S
0
R
39/26
S
45/28
S
73/14
I
01/25
S
0
R
50/12
R
26/19
R
72/23
S
13/23
S
73/16
R
55/21
S
0
R
12b
0
R
25/16
R
56/19
I
0
R
0
R
63/9
R
0
R
41/27
S
76/16
R
94/24
S
29/10
R
91/15
I
82/26
S
45/18
I
17/8
R
59/19
R
01/19
I
9
R
0
R
31/23
S
0
R
11-1
0
R
13/23
S
0
R
0
R
0
R
99/8
R
0
R
99/24
S
57/16
R
86/25
S
0
R
23/15
I
27/27
S
01/22
S
0
R
49/21
S
25
S
78/11
R
0
R
39/24
S
0
R
9b1
90/14
S
80/18
R
0
R
0
R
0
R
69 / 9 R
0
R
32
S
94/21
S
47/37
S
54/13 R
0
R
52/29
S
52/20
S
33/14
R
56/23
S
0
R
0
R
0
R
23
S
0
R
1b
0
R
57/29
S
0
R
0
R
21/18
I
0
R
06/22
S
0
R
30/26
S
64/61
S
0
R
0
R
71/27
S
37/29
S
67/14
R
0
R
0
R
81/30
S
0
R
18/14
I
0
R
11-2
05/29
S
04/30
S
0
R
0
R
0
R
0
R
0
R
81/46
S
29/25
S
20/33
S
45/14
R
98/14
I
18/35
S
94/23
S
0
R
41/25
S
41/25
S
64/12
I
62/32
S
47/32
S
0
R
10b1
35/36
S
06/35
S
41/18
I
0
R
0
R
0
R
0
R
04/43
S
23
S
32/33
S
33/13
R
78/15
I
69/36
S
04/23
S
0
R
71/30
S
71/30
S
15/11
R
47/25
S
0
R
0

Posted in پایان نامه ها

منبع پایان نامه ارشد درمورد محصولات لبنی، بیوتکنولوژی

PIERRE و همکارانش در سال 1987 باکتریوفاژ لیزوژنیک 0448 لاکتوباسیلوس بولگاریکوس LT4 را برای تبدیل شدن به فاژ لیتیک توسط میتومایسین C و پرتویuv القاء کردند. هدف از این مطالعه بر هم کنش باکتریوفاز معتدل لاکتوباسیلوس بولگاریکوس 0448 با سویه های میزبان است. (55)
لاکتوباسیلوس دلبوریکی زیر گونه بولگاریکوس و استرپتوکوکوس ترموفیلوس دو باکتری مهم در صنایع لبنی هستند که به عنوان استارتر در کارخانه های ماست و پنیر به کار می روند. باکتریوفاژ هایی که این باکتری ها به آن ها حساس هستند میزبان را آلوده کرده و باعث شکست در فرایند تخمیر می شود و در نتیجه از نظر اقتصادی مقرون به صرفه نیستند. C.TUKEI و همکارانش 24 باکتریوفاژ ویرولانت لاکتوباسیلوس دلبوریکوس و 23 باکتریوفاژ ویرولانت استرپتوکوکوس ترموفیلوس را در سال 2003 از پنیر و ماست و نمونه های شیر خام جدا کردند. همه ی باکتریوفاژ ها از کارخانه ی پنیر و ماست در انکارا جدا شده است.(15)
2-3- مقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل ها:
Gevers D و همکارانش در سال 2000 به جداسازی و شناسایی باکتری های اسید لاکتیک مقاوم به تتراسایکلین در محصولات گوشتی بسته بندی شده پرداختند. در سال های اخیر زنجیره غذایی یکی از مسیرهای اصلی انتقال مقاومت آنتی بیوتیک بین انسان وحیوان است. هدف، بررسی مقاومت به تتراسایکلین (tetR) باکتری های اسید لاکتیک در محصولات گوشتی که با گاز اتمسفر بسته بندی شده اند که شامل سوسیس خشک، مرغ پخته، خوراک گوشت و همبرگر پخته شده می باشد.
فقط سوسیس خشک شده حاوی سطح بالایی از tetR است و 3 گونه ی لاکتوباسیلوس پلانتاروم، لاکتوباسیلوس ساکی و پدیوکوکوس پنتوسوس به تتراسایکلین مقاوم است.(33)
لاکتوباسیل ها مقاومت ذاتی به تتراسایکلین، ونکومایسین واریترومایسن دارند گرچه مقاومت به استرپتومایسین، کلیندامایسین، جنتامایسین، اگزاسیلین و لینکوزامید ها گزارش شده است. Ashraf, R و همکارانش در سال 2011 مقاومت آنتی بیوتیکی ارگانیسم های پروبیوتیک و امنیت آن ها را در محصولات لبنی بررسی کردند. در این مطالعه از روش دیسک دیفیوژن استفاده شده است و مقاومت انتی بیوتیکی 187 باکتری که از 55 محصول پروبیوتیکی اروپایی جدا شده مورد آزمایش قرار گرفته است که 79 درصد آن ها به کانامایسین مقاوم است و 65 درصد آن ها به ونکومایسین، 26 درصد به تتراسایکلین، 23 درصد به پنی سیلسین G، 16 درصد به اریترومایسین و 11 درصد به کلرامفنیکل مقاوم هستند. در کل 4/68 در صد از آن ها مقاومت چند گانه به آنتی بیوتیک دارند که مقاومت ان ها ذاتی است. (9)
GIOVANNA BLANDINO و همکارانش در سال 2008 به حساسیت آنتی بیوتیکی باکتری های جداشده از محصولات پروبیوتیکی در دسترس در ایتالیا پرداختند. هدف از این مطالعه تعیین حساسیت باکتری های جداشده از 10 محصول پروبیوتیکی در ایتالیا بود. حساسیت 15 سویه لاکتوباسیلوس،5 سویه استرپتوکوکوس سالیواریوس و ترموفیلوس،1 سویه انتروکوکوس فسیوم و 8 سویه بیفیدوباکتریوم در مقابل چندین گروه از عوامل آنتی باکتریال با روش E-Test مورد بررسی قرار گرفت. همه ی سویه های لاکتوباسیل به آمپی سیلین حساس است. مقاومت ذاتی به ونکومایسین در لاکتوباسیلوس سالیواریوس، لاکتوباسیلوس پلانتاروم و لاکتوباسیلوس پاراکازئی اثبات شده است. مقاومت آتیپیک به اریترومایسین در سویه های لاکتوباسیلوس سالیواریوس گزارش شده است. مقاومت مشاهده شده در سویه های به کار برده در محصولات پروبیوتیک ایتالیا به نظر می رسد که ذاتی باشد به استثنای مقاومت به اریترومایسین در یک سویه لاکتوباسیلوس سالیواریوس.(35)
CHANG LIU و همکارانش در سال 2009 به شناسایی مقاومت آنتی بیوتیکی سویه های پروبیوتیک باکتری های اسید لاکتیک جداشده از سوپر مارکت و داروها پرداختند. حساسیت آنتی میکروبیال 41 سویه جداشده توسط روش دیسک دیفیوژن وETest بعد از شناسایی گونه ها مورد بررسی قرار گرفته است. پراکندگی مقاومت در گونه ها یافت شده است. همه سویه های جداشده به کلرامفیکل، تتراسایکلین، آمپی سیلین، آموکسی سیلین، باسیتراسین و اریترومایسین حساس هستند و میزان مقاومت در این آنتی بیوتیک ها نسبتا پایین است. در مقابل اغلب سویه ها به سیپروفلوکساسین، آمیکاسین، تری متوپریم/سولفومتوکسازول و جنتامایسین مقاوم هستند. مقاومت آنتی بیوتیک ها در گونه های مختلف سویه های پروبیوتیک وجود دارد. (16)
Sabine kaster و همکارانش در سال 2006 به بررسی الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی و شناسایی ژن های مقاوم استارتر کالچر ها و پروبیوتیک های به کار برده شده در غذا پرداختند. 200 سویه جداشده از 90 نمونه مختلف که توسط روش های مولکولی و متدها ی دیگر تیپ بندی شده است مورد بررسی قرار گرفته است. 74 سویه متعلق به جنس لاکتوباسیل، 33 نمونه استافیلوکوک، 6 نمونه بیفیدوباکتر و … می باشد. آنها مقاومت فنوتیپیک را برای 20 آنتی بیوتیک مختلف توسط روش دیسک دیفیوژن بررسی کردند. در 27 سویه جداشده مقاومت دیده شده است که ویژگی های جنس ها از قبیل مقاومت فوتیپی و شناسایی خصوصیات ژنتیکی توسط روش هیبریدیزیشن microarray تعیین شده است.
نتیجه این مطالعات شناسایی ژن مقاوم به تتراسایکلین (tet k) در 5 سویه استافیلوکوک جداشده از استارتر کالچر گوشت بوده است واین ژن در lactobacillus reuteri پلاسمیدی است و نیز ژن مقاومت لینکوزامید (lnu A) از لاکتوباسیلوس روتری جداشده است.(6)

فصل سوم
مواد و روش کار

3-1- دستگاه های مورد نیاز:
تجهیزات و لوازم معمول آزمایشگاه میکروبیولوژی به ویژه موارد زیر مورد نیاز است :
جدول3-1: دستگاه های مورد استفاده در تحقیق به همراه مدل آن ها
دستگاه
مدل
اسپکتروفوتومتر
JENWAY 6315
pHمتر
pH/mV/TEMP Meter P25
اتوکلاو

انکوباتور℃ 30
MEMERT
انکوباتور℃ 37
MEMERT
هود میکروبیولوژیکی
JAL-TAJHIZ PRODUCTOIN
فریزر
GFL
میکروسکوپ نوری
ZEISS
فریز داریر
LYOVAC GT3
سانتریفوژ
SAHAND.T.A
حمام آب یا گرمخانه

ترازو
ACCULAB
اون (فور)
Shimifann LABOVEN
ورتکس
Vortex Mixer (VELP)
یخچال
PHILVER , TROPCAL

3-2- لوازم مورد نیاز:
– پلیت های استریل یکبار مصرف، پلیت شیشه ای
– جار بی هوازی
– ارلن
– فالکون
– پیپت مدرج استریل
– لوله آزمایش
– مزور
– سمپلر با حجم 1000-100، 100-10، 10-1 ماکرولیتر
– میکروتیوپ
– پنس فلزی
– خط کش
– لامپ uv
-کولیس

3-3- مواد مورد نیاز:
جدول3-2: مواد مورد نیاز در مطالعه به همراه نام کشور سازنده
ماده
شرکت
Mitomycin C
Sigma
MRS broth
Merck آلمان
Skim Milk
Merck آلمان
Agar
Merck آلمان
دیسک آنتی بیوتیک
پادتن طب
شیر کاله
بازارهای داخلی ایران
Peptone
Merck آلمان
Meat beef
Merck آلمان
Glucose
Merck آلمان
CaCl2
Merck آلمان
K2Hpo4, KH2po4
Merck آلمان
NaOH
Merck آلمان
Yeast Extract
Merck آلمان
Dipotasiom Hydrogen phosphate
Merck آلمان
Twen 80
Merck آلمان
di Amounium hydrogen Citrate
Merck آلمان
Sodium acetate
Merck آلمان
Magnesium sulfate
Merck آلمان
Mangenes
Merck آلمان
سر سمپلر آبی و زرد و سواپ استریل

3-4- سویه های میکروبی مورد مطالعه:
این تحقیق بر روی 65 گونه ی باکتری های لاکتوباسیل جداسازی شده از مناطق مختلف بومی ایران که در سازمان پژوهش های علمی صنعتی ایران گروه بیوتکنولوژی نگه داری شده، انجام شده است.
3-4-2- آماده سازي محيط هاي كشت
محيط هاي كشت مورد استفاده جهت كشت فاژ و حساسیت انتی بیوتیکی عبارتند از:
3-4-2-1- محيط كشت MRS آگار
برای تهیه یک لیتر از این محیط کشت 2/52 گرم محیط کشت MRS ، 15 گرم آگار را در یک لیتر آب جوشیده حل کرده و حرارت داده می شود تا کاملا حل و شفاف شود ( برای تست فاژ اضافه کردن CaCl2 برای چسبندگی فاژ به سویه ی باکتری لازم است ) سپس در دمای 121 درجه سانتی گراد وفشار 6/1 اتمسفر به مدت 15 دقیقه اتوکلاو گردید.
برای اندازه گیری میزان حساسیت و مقاومت لاکتوباسیل ها نسبت به آنتی بیوتیک ها با استفاده از روش دیسک گذاری از محیط کشت MRS استفاده می شود. تهیه ی یک لیتر از این محیط کشت بدین صورت است:
Pepton= 10 gr
Meat beaf=8 gr
Yeast Extract= 4gr
Dipotasiomm Hydrogen Phosphate= 2gr
Glucose= 20gr
Tween 80=1ml
Diamonium Hydrogen Citrate= 2gr
Sodium acetate= 5gr
Magnesium sulfate= 0.2 gr
Manganes= 0.04 gr
3-4-2-2- محيط كشت نرم MRS اگار
برای تهیه یک لیتر از این محیط کشت 2/52 گرم از محیط کشتMRS با 6 گرم آگار را در يك ليتر آب مقطر جوشيده حل كرده و حرارت داده شود تا کاملا حل و شفاف گردد و سپس در دماي ۱۲۱ درجه سانتي گراد و فشار 6/1 اتمسفر به مدت ۱۵ دقيقه اتوكلاو گرديد.
3-4-2-3- محیط کشت MRS مایع
برای تهیه یک لیتر از این محیط کشت 2/52 گرم از محیط کشت MRS را دز یک لیتر آب مقطر حل کرده و بر روی هیتر گذاشته تا کاملا حل و شفاف گردد و سپس در دمای 121 درجه سانتی گراد و فشار 6/1 اتمسفر به مدت 15 دقیقه اتوکلاو گردد.
3-5- کشت و آزمایشات تعیین هویت باکتری ها
ایزوله های مورد بررسی در این مطالعه که قبلا تحت عنوان گونه های لاکتوباسیل جداسازی شده بودند، در دمای 80- درجه سانتی گراد نگه داری شده اند به منظور انجام این تحقیق از باکتری های مورد نظر با استفاده از محیط کشت MRS آگار کشت مجدد ( ساب کالچر) انجام داده تا کلنی تک بدست آید بعد از کلنی تک به صورت متوالی کشت انجام داده تا از خالص بودن باکتری اطمینان حاصل شود و سپس رنگ آمیزی شده و با میکروسکوپ نوری مشاهده شود.

3-6- سنجش فاژ
3-6-1- روش دولایه ای پلاک
در این روش فاژها توسط میتومایسین C القا می گردد ( فاز لیزوژنیک به فاز لیتیک فاژ تبدیل می شود). ابتدا 10 میلی لیتر محیط کشت MRS آگار (میزان آگار 5/1 درصد می باشد) درون پلیت ها ریخته و پلیت ها به صورت آماده می باشد همانطور که قبلا ذکر شد. لوله هایی که حاوی 5/4 میلی لیتر محیط کشت نرم MRS آگار ( میزان آگار 6/0 درصد می باشد) می باشند را به دمای 40 درجه سانتی گراد رسانده سپس 100میکرولیتر (0.1 ml) CaCl2 10Mm و 5/0 میلی لیتر میتومایسین C (0/2 mgr/ml ) و 1/0 میلی لیتر از سوسپانسیون باکتری به آن تلقیح کرده لازم به ذکر است که همه ی این موارد باید به دمای 40 درجه سانتی گراد رسیده باشند. لوله هایی که شامل تمام این محتویات می باشد را در سطح پلیت های MRS آگار پخش کرده به طوریکه تمام سطح را بپوشاند. سپس این پلیت ها را درون جار بی هوازی و داخل انکوباتور قرار داده و پس از 24 ساعت پلاک ها مشاهده می شوند.
3-6-2- مشاهده پلاک توسط القاء با پرتوUV
5/0-1/0میلی لیتر از سوسپانسیون باکتری را در پلیت ریخته ( براساس میزان کدورت باکتری) و پلیت ها را در معرض تابش لامپ uv( 280 nm) قرار می دهیم. سپس1/0 میلی لیتر CaCl2 (( 10Mm و 5/9 میلی لیتر محیط کشت نرم MRS را در پلیت پخش کرده و پلیت ها را به صورت دورانی یا زیگزاک حرکت می دهیم تا به طور یکنواخت پخش شوند. پلیت ها را دورن جار بی هوازی و دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت قرار می دهیم. سپس حضور یا فقدان پلاک را گزارش می کنیم.

شکل3-1 – پلاک
3-6-3- آزمون Heap and Lawrence
تست فعالیت استارتر کالچر 66 توسط هیپ و لورنس شرح داده شده است. لوله های حاوی 5 میلی لیتر شیر پاستوریزه ( شیر کم چرب کاله) به مدت یک ساعت در80 درجه سانتی گراد بخار داده شوند و سپس دمای آن را به 30 درجه سانتی گراد می رسانیم. 1/0 میلی لیتر از سوسپانسیون باکتری را به لوله های حاوی شیر تلقیح کرده و سپس آن ها را گرماگذاری می کنیم. پروفایل انکوباسیون بدین صورت می باشد: 100 دقیقه دمای ℃30 ، 190 دقیقه دمای ℃ 40 و 100 دقیقه دمای ℃ 30. بعد از گرماگذاری PH نهایی بررسی می شود. اگر بعد از گرماگذاری PH به زیر 6 تغییر نیابد و اسید تولید نشود به معنی حضور فاژ است. (70،37،36)

3-7- سنجش

Posted in پایان نامه ها

منبع پایان نامه ارشد درمورد مورفولوژی، اتحادیه اروپا، محصولات لبنی

می نماید. این مکانیسم منحصر به فرد بوده و در مقاومت متقاطع با دیگر مهار کننده هی پروتئین دیده نمی شود.

1-9-5-3-4- کلرامفنیکل
طیف آنتی باکتریال وسیعی مشابه تتراسایکلین دارد.
اثر باکتریواستاتیک کلرامفنیکل به علت اتصال قابل برگشت به پپتیدیل ترانسفراز زیر واحد S50 ریبوزوم است که طویل شدن پپتیدها را بلوکه می نمایند. مقاومت نسبت به کلرامفنیکل در باکترهایی مشاهده می شود که دارای پلاسمیدهای کد کننده کلرامفنیکل استیل ترانسفراز بوده و باعث استیله شدن گروه 3- هیدروکسی کلرامفنیکل می شود. این محصول قادر به اتصال به زیر واحد S50 نیست.
1-9-5-3-5- ماکرولیدها
اریترومایسین از استرپتومیسس اریترئوس55 بدست می آید و نمونه هایی از آنتی بیوتیک ماکرولیدی است. اصلاح ساختمان ماکرولید به تولید عوامل جدیدتری از قبیل آزیترومایسین و کلاریترومایسین منجر شده است. ماکرولیدها آنتی بیوتیک های باکتریواستاتیک وسیع الطیف هستند. اثر ماکرولید ها با اتصال قابل برگشت به زیر واحد S50 ریبوزوم و بلوکه کردن طویل شدن پلی پپتید، اعمال می شود. (68)
1-9-5-3-5-1- مقاومت به ماکرولیدها:
ناشی از متیلاسیون SrRNA 23 که مانع اتصال به آنتی بیوتیک می شود.
تخریب حلقه لاکتون توسط آنزیم اریترومایسین استراز
انتشار فعال دارو از سلول باکتری

1-9-5-3-6- کلیندامایسین
کلیندامایسین ( از خانواده لینکوزامید) مشتقی از لینکومایسین می باشد. کلیندامایسین مانند کلرامفنیکل و ماکرولیدها، طویل شدن پروتئین ها را با اتصال به زیر واحد s50 ریبوزوم بلوکه می نماید. این آنتی بیوتیک با تداخل در اتصال کمپلکس آمینو اسید- آسیل- ERNA، پپتیدیل ترانسفراز را مهار می نماید. متیلاسیون srRNA23 اریترومایسین منبع مقاومت باکتری است. از آنجائی که کلیندامایسین و اریترومایسین، مقاومت آنزیماتیک را القاء می نمایند ( همچنین به واسطه ی پلاسمید)، مقاومت متقاطع بین این دو آنتی بیوتیک مشاهده می شود.
جدول1-5: ماکرولیدها و تتراسایکلین
آنتی بیوتیک
طیف اثر
ماکرولیدها (اریترومایسین، کلاریترومایسین و آزیترومایسین)

تتراسایکلین ها ( تتراسایکلین، دوکسی سایکلین، مینوسایکلین)
آنتی بیوتیک های وسیع الطیف موثر بر باکتری های گرم منفی و گرم مثبت، نایسریا، لژیونلا، مایکوپلاسما، کلامیدیا، کلامیدیا وفیلا، ترپونما و ریکتزیا،. کلاریترومایسین و آزیترومایسین موثر بر برخی مایکوباکتریوم ها.

آنتی بیوتیک های وسع الطیف با اثری شبیه ماکرولید ها.

1-9-5-3-7- استرپتوگرامین ها
استرپتوگرامین ها گروهی از پپتیدهای حلقوی هستند که بوسیله ی گونه های استرپتومیسس تولید می شوند. این آنتی بیوتیک به صورت ترکیبی از دو ماده استرپتوگرامین گروه A و گروهB تجویز می شوند که به صورت سینرژیست اثر کرده و موجب مهار سنتز پروتئین می گردند. آنتی بیوتیکی از این گروه که در حال حاضر در دسترس می باشد کواینوپریستین – دالفوپریستین 56 است که نام تجاری آن سینرسید است.
1-9-5-4- آنتی بیوتیک های مهار کننده سنتز اسید نوکلوئیک
1-9-5-4-1-کینولون ها
کینولون ها عوامل شیمی درمانی صناعی می باشند که DNA ژیراز و توپوایزومرازهای باکتری را که در همانندسازی DNA ، نوترکیبی و ترمیم مورد نیاز است را مهار می کند.DNA ژیراز از زیر واحد آلفا و دو زیر واحد بتا تشکیل شده است که کینولون ها به زیر واحد الفا متصل می شوند. تغییر در این زیر واحد عنوان مکانیزم اصلی مقاومت باکتری است، گرچه کاهش در جذب دارو نیز مشاهده می شود. کاهش در جذب ناشی از تغییر در پروتئین های پورین در سطح باکتری مشاهده می شود که هر دو نوع مقاومت کروموزومی است. (12و14)
جدول1-6: کینولون ها
آنتی بیوتیک طیف اثر
طیف کم : نالیدیکسیک اسید موثر بر باسیل های گرم منفی، بی اثر بر گرم
مثبت ها

طیف اثر وسیع ( سیپروفلوکساسین، لوفلوکساسین، آنتی بیوتیک های وسیع الطیف با فعالیت بر
لومه فلوکساسین، توروفلوکساسین، اوفلوکساسین باکتری های گرم مثبت وگرم منفی

طیف گسترده (گاتی فلوکساسین، گریافلوکساسین، آنتی بیوتیک وسیع الطیف با افزایش فعالیت بر
کلینافلوکساسین، موکسی فلوکساسین) باکتری های گرم مثبت ( به خصوص استرپتوکوکها
و انتروکوک ها ) در مقایسه با کینولون های اولیه.
اثری مشابه با سیپروفلوکساسین و کینولون های
مرتبط بر باسیل های گرم منفی

1-9-5-4-2- ریفامپین و ریفابوتین
ریفامپین مشتق نیمه صناعی از ریفامایسینB است که از استرپتومایسیس مدیترانه ای تولید می شود. این آنتی بیوتیک به RNA پلی مراز وابسته به DNA متصل شده و شروع سنتز RNA را مهار می نماید
1-9-5-4-3- مترانیدازول
مترانیدازول در درمان واژینیت های تریکومونائی تجویز می شود. خواص ضد میکروبی مترانیدازول ناشی از احیای گروه نیترو به وسیله نیتروردکتاز باکتری است که موجب تولید ترکیبات سیتوتوکسیک و در نتیجه تخریب DNA میزبان میگردد. مقاومت به علت کاهش جذب آنتی بیوتیک یا حذف ترکیبات سیتوتوکسیک قبل از واکنش با DNA میزبان صورت می گیرد.(68 ،13)
1-9-5-4-4- آنتی متابولیت ها
سولفانامیدها 57، آنتی متابولیت هستند که با پاراآمینوبنزوئیک اسید رقابت کرده و در نتیجه از سنتز اسید فولیک که برای میکروارگانیسم های خاص لازم است، جلوگیری می کنند.
تری متوپریم58 آنتی متابولیت دیگری است که با مهار دی هیدروفولات ردکتاز59 در سنتز اسیدفولیک تداخل کرده، در نتیجه تبدیل دی هیدروفولات به تتراهیدروفولات 60جلوگیری می کند. این عمل مهاری تشکیل تیمیدین، برخی پورین ها، متیونین ها وگلایسین را بلوکه می کند. تری متوپریم معمولا با سولفومتوکسازول ترکیب می شود تا در دو مرحله در سنتز اسید فولیک اثر سینرژیک داشته باشد. مقاومت به این آنتی بیوتیک ها از طریق مکانیسم های مختلفی صورت می گیرد. مقاومت به تری متوپریم می تواند به علت کاهش تماس دی هیدروفولات ردکتاز باشد.

1-9-6- اهمیت مقاومت آنتی بیوتیکی در دام:
آنتی بیوتیک در حیوانات به سه منظور استفاده می شود.(43)
1- نقش درمانی
2-پیشگیری از بیماری
3-به عنوان محرک رشد61
پرورشگاه های دام از نظر استفاده از آنتی بیوتیک به منظور درمان مورد بازخواست قرار نمی گیرند اما آزمایشات فراوانی برای استفاده از آنتی بیوتیک به عنوان محرک رشد انجام می گیرد. اینکه آیا استفاده از آنتی بیوتیک تاثیر مثبت در سلامت انسان دارد یا خیر بحث های فراوانی صورت می گیرد. اتحادیه اروپا آووپارسین62 (گلیکوپپتیدی که مقاومت متقاطع با ونکومایسین دارد) ویرجینیامایسین63 (استرپتوگرامین) باسیتراسین (که به عنوان دارو در انسان استفاده می شود) تایلوزین64 و اسپیرامایسین65 (هر دو ماکرولید ) که به عنوان افزودنی در غذا استفاده می شوند را ممنوع اعلام کرده است.
Swann در سال 1969 گزارش کرده است که آنتی بیوتیک هایی که برای درمان در انسان استفاده می شوند هرگز به عنوان محرک رشد نباید مورد استفاده قرار گیرند ولی این امر در کشورهای خارج از اتحادیه اروپا پذیرفته نشده است. به عنوان مثال در آمریکا 19 آنتی بیوتیک مختلف از قبیل پنی سیلین، استرپتومایسین و… که قبلا به منظور دارو در انسان و علم پزشکی استفاده شده امروزه به منظور محرک رشد مورد استفاده قرار می گیرد.
انتقال مقاومت آنتی بیوتیکی از طریق زنجیره غذایی بیماری هایی را نیز در انسان بوجود می آورد.
استفاده از انتی میکروبیال ها در حیوانات محدود نشده است و برای رشد و پرورش دام و طیور بدون توجه به پیامدهای آن مورد استفاده قرار میگرند. (43)

فصل دوم :
مروری بر ادبیات و پیشینه تحقیق

2-1- تاریخچه
اولین مطالعه فاژ در سال 1915 و 1917 توسط Fredrick twort ,Flex d Herelle صورت گرفت که کلنی های باکتری نیمه شفاف و نقاط شفاف را در محیط کشت باکتریایی مشاهده کرد. dHerelle این میکرب نامرئی را باکتریوفاژ نامید. اولین بار علاقه به تحقیق در مورد فاژها به سبب استفاده از فاژها به عنوان ابزارهای درمانی در مقابل بیماری های باکتریایی بوده است. بعد از معرفی آنتی بیوتیک در سال 1940 علاقه به درمان توسط فاژ از سوی غرب آغاز شد. دلیل توجه به درمان توسط فاژ، افزایش مقاومت باکتری های پاتوژن به آنتی بیوتیک بوده است که به یک روش جایگرین برای درمان بیماری های باکتریایی نیاز پیدا کردند. (57)
2-2- مطالعات انجام شده در باکتریوفاژ:
Ranata G. k و همکارانش به بررسی فاژهای لاکتوباسیلوس دلبوریکی و لاکتوباسیلوس رامنوسوس پرداختند. این مطالعه به پیشرفت استارترهای مقاوم به فاژدر صنعت لبنی که اطلاعات ژنتیکی و عناصر تنظیم کننده ی مناسب برای کاربردهای بیولوژیکی فراهم می کند، کمک می کند. این مطالعه فهم بهتر تکامل ژنوم فاژهای لاکتوباسیل را که سبب توسعه استارترهای مقاوم به فاژ و استفاده طولانی مدت از آنها در صنعت لبنی می شود، فراهم می کند. (66)
x.zahang و همکارانش در سال 2005 به جداسازی و شناسایی فاژ های معتدل لاکتوباسیلوس فرمنتیوم از محصولات لبنی (ماست) در چین پرداختند. هدف از این مطالعه بررسی خصوصیات فاژ معتدل لاکتوباسیلوس فرمنتیوم بر اساس مورفولوژی، الگوی مهاری، پروفایل پروتئینی و تاثیر در رشد سویه های میزبان می باشد. فاژها با میتومایسین C القاء شدند. این مطالعه اطلاعاتی را به ما درباره ی باکتریوفاژها در کارخانه های لبنی در چین می دهد و دانش ما را درباره ی تنوع فاژ ها می افزاید.(71)

A O Kiliç, S I Pavlova, W G Ma and L Tao Appl در سال 1996 به آنالیز فاژهای لاکتوباسیلوس و
ویژگی فاژهای جداشده از آنها در محصولات لبنی آمریکا پرداختند . گونه های باکتری بررسی شده در این
مطالعه Termofillus LB.delbrueckii subsp bulgaricus , Sterptococcus است که با هم سبب
تخمیر شیر تولید ماست می شوند .
در سال 1986 به بررسی16 Mireille Mata, Annie Trautwetter, Gisèle Luthaud , Paul Ritzentha
) و 13 فاژ ویرولانت که این فاژها از کارخانه ی ماست و پنیر جدا شده بود.Mv1 , Mv4)فاژ پرداختند .2 فاژ معتدل
13 فاژ ویرولانت و 2 فاژ معتدل مربوط به 2 گونه ی باکتریایی وابسته به ( LB.Bulgaricus ,LB.lactice)
می باشند این فاژها از نظر خصوصیات مورفولوژی ، آنتی ژنی و دیگر خصوصیات با همدیگر مقایسه شده اند.
Wang S, Kong J, Gao C, Guo T, Liu X در سال 2010 به جداسازي وشناسائي فاژ ويرولانت ( phil db
bulgaricus از نمونه های ماست پرداختند . شناسائي اين فاژها به استراتژي کنترل فاژ و مهار فاژهاي کارخانه هاي لبني کمک مي کند.
Zago M, De Lorentiis A, Carminati D, Comaschi L, Giraffa G در سال 2006 در ايتاليا به جداسازي و شناسائي باکتريوفاژهاي Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis توسط PCR پرداختند. با استفاده از روش PCR ذرات داخلي پروتئين هاي اصلي دم را تکثیر کردند تا به شناسائي باکتريوفاژهاي ليتيک LB.lactis بپردازند. حضور فاژهاي فعال در حال رشد توسط روش هاي سنتي تصديق شد و روش PCR براي غربالگری و حضور فاژها delbrueckii subsp.lactis LB. در استارتر هاي Whey روشی مناسب است.
Joseph J.Chow و همکارانش در سال 1998 به منظور تعیین ویژگی های فاژch2 لاکتوباسیلوس بولگاریکوس به تکثیر و خالص سازی این باکتریوفاژ پرداختند. آن ها ویژگی های این فاژ را بر اساس مورفولوژی، اندازه ژنوم، پروتئین های ساختاری و سینتیک رشد بررسی کردند.(44)
JEAN CLUZEL,

Posted in پایان نامه ها

منبع پایان نامه ارشد درمورد بیوتیک، سیلین، بتالاکتام

کننده سنتز نوکلوئیک اسید

ریفامپین

مهارکننده سنتزRNA

ایزونیازید

آنتی بیوتیک های مهارکننده سنتز مایکولیک اسید

سولفانامید ها
تری متوپریم

آنتی بیوتیک های مهار کننده سنتز فولیک اسید

1-9-5-1- آنتی بیوتیک های ممانعت کننده از سنتز دیواره سلول:
متداول ترین مکانیسم فعالییت آنتی بیوتیک، تداخل در سنتز دیواره سلول باکتری است بیشتر آنتی بیوتیک های موثر بر دیواره سلول تحت عنوان آنتی بیوتیک های بتا-لاکتام (مانند پنی سیلین ها، سفالوسپورین ها، سفامایسین، کرباپنم، مونوباکتم، مهارکننده های بتا لاکتاماز ) طبقه بندی شده اند و چون حلقه بتالاکتام در ساختمان آنها مشترک است به این نام خوانده شده اند.
آنتی بیوتیک های دیگری که در ساختار دیواره سلول اثر می کنند عبارتند از ونکومایسین، باسیتراسین و عوامل ضد مایکوباکتریومی مانند ایزونیازید، اتامبوتول، سایکلوسرین و اتیونامید.

1-9-5-1-1- آنتی بیوتیک ها ی بتا-لاکتام:
ترکیب اصلی ساختمان دیواره سلولی باکتری لایه پپتیدوگلیکان می باشد. ساختمان اصلی ، زنجیره ای از 10 تا 65 قطعه ی دی ساکاریدی شامل ان- استیل گلوکوزآمین و ان-استیل مورامیک اسید است. اتصال عرضی این زنجیره ها بوسیله پل های پپتیدی انجام می شود که باعث بوجود آمدن شبکه ای سخت شده و باکتری را در بر می گیرد.
ساخته شدن زنجیره ها و پل های عرضی به وسیله ی آنزیم های خاصی مانند ترانس پپتیداز، کربوکسی پپتیداز و اندپپتیداز صورت می گیرد. آنزیم های تنظیم کننده نیز پروتئین های متصل شونده به پنی سیلین PBPS نامیده می شوند زیرا آنها می توانند به آنتی بیوتیک های بتالاکتام متصل شوند. وقتی باکتری های در حال رشد در معرض این آنتی بیوتیک قرار می گیرد، آنتی بیوتیک به PBPS در دیواره متصل می شوند، بنابراین سنتز دیواره سلول را بدون تاثیر بر برگشت turnover (degradation) پپتیدوگلیکان، مهار می کند که منجر به مرگ سلول می گردد. بنابراین، آنتی بیوتیک های بتالاکتام عموما به عنوان عوامل باکتریسیدال عمل می کنند. (13)
1-9-5-2- مقاوت نسبت به آنتی بیوتیک بتالاکتام با یکی از سه مکانیسم زیر صورت می گیرد:
جلوگیری از واکنش بین آنتی بیوتیک با PBP هدف
کاهش اتصال بین آنتی بیوتیک به PBP
هیدرولیز آنتی بیوتیک به وسیله بتالاکتاماز ها

1-9-5-2-1- پنی سیلین ها:
ترکیب اصلی آن ها یک اسید آلی با یک حلقه بتالاکتام است که از کشت قارچ پنی سیلیوم کریزوژنوم46 بدست می آید. اگر قارچ با یک فرایند تخمیری رشد داده شود، مقادیر زیادی از واسطه ی کلیدی 6- آمینو پنی سیلانیک اسید ( حلقه بتالاکتام با یک حلقه تیازولیدین) تولید میشود. (32) آمپی سیلین اولین آنتی بیوتیک پنی سیلین با طیف وسیع می باشد . گروه جدیدی ا زپنی سیلین ها، از ترکیب با ممانعت کننده های بتالاکتاماز ساخته شده اند. ممانعت کننده ها به طور غیر قابل برگشت به بتالاکتامازهای باکتری های حساس متصل شده و آن ها را غیرفعال می سازند (گرچه همه به ممانعت کننده متصل نمی شود) و اجازه می دهد که این ترکیب دارویی سنتز دیواره سلول را مختل نماید.
جدول1-3- پنی سیلین ها و طیف اثر آن ها
آنتی بیوتیک
طیف فعالیت
پنی سیلین ها ی طبیعی (پنی سیلین6، پنی سیلین7)

پنی سیلی های مقاوم به پنی سیلیناز (نافی سیلین، متی سیلین، اگزاسیلین، کلوگزاسیلین، دی گلوکزاسیلین )

پنی سیلین ها با طیف وسیع (امپی سیلین، اموکسی سیلین، کربنی سیلین، تیکاریسیلین، مزلوسیلین، پی پراسیلین)

بتالاکتام با مهار کننده های بتالاکتاماز (اموکسی سیلین، کلاونیک اسید، آمپی سیلین/ سولباکتام، تیکاریسیلین، پی پراسیلین/تازوباکتام
موثر بر علیه استرپتوکوک های بتاهمولیتیک و بیشتر استرپتوکوک ها، فعالییت محدود بر علیه استافیلوکوک ها، موثر بر مننگوکوکسی و بیشتر گرم مثبت های بیهوازی ، اثر ضعیف بر باسیل های گرم منفی هوازی و بی هوازی

مشابه پنی سیلین های طبیعی بجز افزایش فعالییت بر علیه استافیلوکوک

فعال بر علیه کوکوس های گرم مثبت مشابه به پنی سیلین های طبیعی،فعال بر علیه بیشتر باسیل های گرم منفی

فعالییت مشابه بتالاکتام ها به اضافه بهبود فعالییت بر علیه استافیلوکوک ها ی مولد بتالاکتاماز و باسیل های گرم منفی انتخابی، بتالاکتامازها مهار نمی شوند و پی پراسیلین/ تازوباکتام فعال ترین داروست.

1-9-5-2-2- سفالوسپورین و سفامایسین ها:
سفالوسپورین ها آنتی بیوتیک های بتالاکتامی هستند که از 7- آمینوسفالوسپورانیک اسید ( ترکیب حلقه ی بتالاکتام با حلقه دی هیدروتیازین) مشتق شده اند که از قارچ سفالوسپوریوم بدست می آیند.
سفامایسین ها شبیه سفالوسپورین ها می باشند به غیر از این که در حلقه دی هیدروتیازن به جای گوگرد، اکسیژن قرار دارد و در نتیجه نسبت به هیدرولیز توسط بتالاکتاماز پایدارترند.
مکانیزم عمل سفالوسپورین ها و سفامایسین ها همانند پنی سیلین ها بوده ولی طیف آنتی باکتریال وسیع تری داشته، به بسیاری از بتالاکتاماز ها مقاوم بوده و خواص فارماکوکینتیک آن اصلاح شده است.
آنتی بیوتیک های نسل اول دارای دامنه ی فعالیت کم 47 می باشد. بسیاری از آنتی بیوتیک های نسل دوم دارای فعالیت گسترده تر48 است . نسل سوم و نسل چهارم آنتی بیوتیک ها با طیف وسیع 49 بر روی بیشتر انتروباکتریاسه ها و سودوموناس آئروژینوزا موثر هستند. پایداری آنتی بیوتیک ها باطیف گسترده نسبت به بتالاکتامازها افزایش پیدا کرده است.
جدول1- 4: مثال های انتخابی از سفالوسپورین ها و سفامایسین ها و طیف اثر آن ها
آنتی بیوتیک
طیف اثر
طیف کم (سفالکسین، سفالوتین-سفرادین) سفازولین، سفاپیرین

فعالییتی مشابه اگزاسیلین بر باکتری های گرم مثبت، اثر بر برخی گرم منفی ها( مانند اشرشیا کلی، کلبسیلا، پروتئوس میرابیلیس
طیف گسترده (سفاکلر، سفامندول، سفوروکسیم) سفوتتان، سفوکسیتیم
فعالیتی مشابه اگزاسیلین ببر باکتری های گرم مثبت، فعالیت بهتر بر گرم منفی ها شامل انتروباکتر، سیتروباکتر و دیگر گونه های پروتئوس
طیف وسیع (سفکسیم، سفوتاکسیم، سفتریاکسون، سفتازیدیم
فعالیتی مشابه اگزاسیلین بر باکتری ها ی گرم مثبت فعالیت بهتر بر گرم منفی ها شامل سودوموناس
طیف گسترده (سفپیم، سفپیروم)
فعالیتی مشابه اگزاسیلین بر گرم مثبت ها، فعالیت بسیار عالی بر گرم منفی ها
از دیگر آنتی بیوتیک های بتالاکتام کرباپنم ها ( ایمی پنم ، مروپنم) و مونوباکتام ها ( مانند آزترونام) هستند. کرباپنم ها آنتی بیوتیک های با طیف وسیع هستند که بر روی تمام ارگانیسم ها به استثنای چند مورد موثرند. در مقایسه مونوباکتام طیف اثر کمی داشته و فقط بر روی باکتری های گرم منفی هوازی موثرند. برتری این انتی بیوتیک ها استفاده آن ها در درمان عفونت های خاص بدون اثر بر باکتری های فلور نرمال می باشد.
1-9-5-2-3-گلیکوپپتیدها:
ونکومایسین که از استرپتومایسین اورینتالیس 50بدست می آید، گلیکوپپتیدی مرکب می باشد که از سنتز پپتیدوگلیکان دیواره سلولی در باکتری های گرم مثبت در حال رشد، جلوگیری می کند.
ونکومایسین بر دی آلانین_ دی آلانین انتهایی زنجیره جانبی پنتاپپتیدی اثر کرده ومانع تشکیل پل عرضی بین زنجیره های پپتیدوگلیکان می گردد.
ونکومایسین اثری بر باکتری های گرم منفی ندارد، زیرا مولکول های آن خیلی بزرگ بوده و نمی تواند از غشاء خارجی عبور نموده و به سایت هدف در پپتیدوگلیکان برسد. علاوه بر این، برخی ارگانیسم ها ذاتا به ونکومایسین مقاوم( لاکتوباسیل ها ، لوکونوستوک، پدیوکوکوس، اریزیپلوتریکس) چون دی ساکارید انتهایی پنتاپپتید آن ها، دی آلانین-دی لاکتات بوده و به ونکومایسین متصل نمی گردد.
ژن های مقاومت که باعث تغییر در بخش انتهایی پپتید می شود بر روی پلاسمید قرار دارد .
1-9-5-2-4- پلی پپتیدها:
باسیتراسین که از باسیلوس لیکنی فرمیس بدست می آید، مخلوطی از پلی پپتیدها می باشد. باسیتراسین در فسفریلاسیون و جایگزینی مجدد لیپد های ناقل که مسئول انتقال پیش سازهای پپتیدوگلیکان از غشاء سیتوپلاسمی به دیواره سلولی است، تداخل کرده و در نتیجه سنتز دیواره سلول را مهار می نماید این آنتی بیوتیک ممکن است به غشاء سیتوپلاسمی آسیب رسانده و نسخه برداری RNA را مهار نماید. به نظر می رسد که مقاومت به این داروها بیشتر به عدم نفوذ دارو به داخل سلول باکتری باشد.
1-9-5-2-5- ایزونیازید، اتیونامید، اتامبتول و سیکلوسرین:
این ها آنتی بیوتیک های موثر بر دیواره سلولی هستند که در درمان عفونت های مایکوباکتریال استفاده می شوند. گرچه مکانیسم دقیق آنها شناخته شده نیست، سنتز اسید مایکولیک تحت تاثیر قرار می گیرد( مانع اشباع شدن اسیدهای چرب با زنجیره بلند و طویل شدن اسیدهای چرب و هیدروکسی لیپیدها می شود.
اتیونامید سنتز اسید مایکولیک را متوقف می نماید. اتامبوتول با سنتز آرابینوگالاکتان در دیواره سلولی تداخل ایجاد کرده و سیکلوسرین دو آنزیم دی آلانین-دی آلانین راسماز را که در سنتز دیواره سلوی کاتالیز می کنند مهار می نماید.
مقاومت به این چهار آنتی بیوتیک ناشی از جذب دارو به داخل سلول باکتری و یا تغییر در سایت هدف است.
1-9-5-3- آنتی بیوتیک های مهار کننده از سنتز پروتئین:
1-9-5-3-1- آمینوگلیکوزیدها
آنتی بیوتیک های آمینوگلیکوزیدی شامل قندهای آمین دار هستند که با اتصالات گلیکوزیدی به یک حلقه آمینوسیکلیتول متصل شده اند.
استرپتومایسین، نئومایسین، کانامایسین، توبرامایسین از گونه های استرپتومایسس51 و جنتومایسس و سیزومایسین52 از گونه های میکرومونوسپورا 53 بدست می آید.
آمیکاسین و نتیل میسین54 به ترتیب مشتقات صناعی کانامایسین و سیزومیسین می باشد.
این آنتی بیوتیک ها از غشاء خارجی باکتری ( در باکتری های گرم منفی)، دیواره سلولی و غشاء سیتوپلاسمی عبور کرده و به سیتوپلاسم می رسند و با اتصال غیر قابل برگشت به پروتئین های s30 ریبوزومی، سنتز پروتئین های باکتری را مهار می نماید. این اتصال دو اثر بر روی ریبوزوم می گذارد: یکی تولید پروتئینهای نادرست و ناقص در نتیجه غلط خوانی RNA پیامبرو دیگری تداخل در سنتز پروتئین به وسیله آزادشدن نابهنگام، ریبوزوم از mRNA.
آمینوگلیکوزیدها به دلیل اتصال غیر قابل برگشت به ریبوزوم باکترسیدال می باشد. جنتامایسین و توبرامایسین رایج ترین آنتی بیوتیک ها این گروه هستند که طیف اثر وسیعی دارند.
مقاومت به اثر ضد باکتریال آمینوگلیکوزیدها به سه طریق ایجاد می شود:
1-موتاسیون در محل اتصال ریبوزومی
2- کاهش جذب آنتی بیوتیک به سلول باکتری یا اصلاح آنزیماتیک آن.
3-مهار انتقال آنتی بیوتیک به سلول های باکتری
اصلاح آنزیماتیک آمینوگلیکوزیدها به وسیله فسفریلاسیون، آدنیلاسیون، استیلاسیون گروه های آمینی و هیدروکسیل آنتی بیوتیک ها شایع ترین نوع مکانیسم مقاومت است.(23 ،12)

1-9-5-3-2- تتراسایکلین:
تتراسایکلین ها آنتی بیوتیک های وسیع الطیف و باکتریواستاتیک هستند که سنتز پروتئین ها را به وسیله اتصال غیر قابل برگشت به زیر واحد s30 ریبوزوم باعث مهار آن شده و در نتیجه اتصال آمینواسیل را به کمپلکس tRNA – زیر واحد s30بلوکه می نماید. (12،10)
1-9-5-3-2-1- مقاومت به تتراسایکلین
کاهش نفوذ آنتی بیوتیک به سلول باکتری
انتشار فعال دارو به خارج سلول شایع ترین نوع مقاومت به تتراسایکلین
تغییر در سایت هدف ریبوزوم یا اصلاح آنزیملتیک باکتری
تولید پروتئین ها مشابه فاکتورهای طویل کننده باشد که از ریبوزومS 30 محافظت می نماید در این صورت آنتی بیوتیک به ریبوزوم متصل شده ولی سنتز پروتئین را متوقف نمی نماید.
جهش هایی که در ژن کروموزومی کد کننده پروتئین های پورین غشاء خارجی OmpF رخ می دهد می تواند به مقاومت در سطح پائین تتراسایکلین ها و آنتی بیوتیک های دیگر (مانند بتالاکتام ها، کینولون ها، کلرامفنیکل ) منجر گردد.
1-9-5-3-3- اگزازولیدینون ها
اگزازولیدین ها گروهی از آنتی بیوتیک ها هستند که طیف اثر کمی دارند و آغاز سنتز پروتئین را با تداخل در تشکیل کمپلکس آغازگر در سایت زیر واحد S 30 بلوکه

Posted in پایان نامه ها

منبع پایان نامه ارشد درمورد محصولات لبنی، محصول لبنی، درمان بیماران

شود . فاژها به هیپوکلریت و گرما حساس هستند و از این طریق می توانند از تجهیزات و محیط های کشت زدوده شوند.
فاژها می توانند از طریق پخش شدن آب پنیر، هوا و توسط افراد منتقل شوند بنابراین این موارد نقاط کنترلی مهمی میباشند. در نتیجه تا زمانی که یک تولید کننده شرایط بهداشتی عالی را به کار نگیرد و سیستم های مناسب انتقال هوا در محیط وجود نداشته باشد( مثل فیلترهای HEPA، فشار مثبت در اتاق کشت و غیره) و محل انجام فرایند بر روی آب پنیر از سالن جدا نگردد تا عبور و مرور افراد محدود شود، فناوری پیشرفته برای برای کنترل فاژها شانس کمی برای موثر بودن خواهد داشت. حتی وقتی برنامه های مناسب بهداشتی اجراء می شوند، فاژها از محیط ساخت پنیر حذف نمی شوند و هر جائیکه باکتری های اسید لاکتیک در حال رشد وجود دارند، فاژها نیز حضور دارند و به آن ها نیز حمله می کنند. با توجه به این واقعیت سازندگان مایه کشت نوع جدیدی از محصولات را ارئه کرده اند که رشد فاژها را کنترل و یا متوقف می کنند.که شامل:
محیط های کشت بازدارنده فاژها
مایه کشت مقاوم به فاژ
برنامه های چرخشی مایه کشت
تانک مایه کشت انبوه، اولین مکانی است که تکثیر فاژ در آن اتفاق می افتد به طور سنتی از شیر یا آب پنیر بعنوان محیط کشت استفاده می شود علاوه بر اینکه باکتری های اسید لاکتیک به خوبی رشد می کنند، رشد فاژها نیز بخوبی صورت می گیرد. برعکس محیطهای کشت بازدارنده فاژ هم محیط هایی با پایه آب پنیر یا پایه شیر هستند اما علاوه بر فاکتورهای تغذیه ای و رشد، حاوی نمکهای فسفات و سیترات می باشند. با وجود استفاده گسترده از این روش اثرات کمی بر کنترل فاژ مشاهده می شود.
میکروبیولوژیست های لبنی از مدتها به دنبال لاکتوکوکسی ها و سایر باکتری های اسید لاکتیک هستند که به طور طبیعی در مقابل فاژ مقاوم باشند گرچه چنین نژادهایی وجود دارند ولی فاقد خواص لازم برای ساخت محصولات لبنی هستند آنها یا رشد کندی داشته یا محصولی با کیفیت پایین تولید می کنند و یا در انتهای عمل به فاژ آلوده می شوند.
یک روش موفقیت آمیز دیگر ایزوله کردن نژادهای خودبخود جهش یافته مقاوم به فاژ می باشد که با در معرض قرار دادن مداوم نژادهای تولید کننده محصول لبنی در برابر فاژهای دائمی حاضر در محیط مشخص بدست می آیند. برای اطمینان از اینکه خواص تخمیری دچار تغییر نشده است باید آن ها را برای سرعت تولید اسید در زمان در معرض فاژها، تحت شرایط مشابهی که برای تولید محصول لبنی استفاده می شود قرار داد که از آزمون هیپ و لورنس ( روش هیپ و لورنس، برگرفته از نام دو محقق نیوزلندی ) که قوی ترین و موثرترین روش برای توسعه محیط های کشت مقاوم به فاژ می باشداستفاده شود. مکانیسم های متفاوتی برای فنوتیپ مقاوم به فاژ در باکتری های اسید لاکتیک شناسایی شده است. به طور کلی نژادهای مقاوم به فاژ، فرایند ابتلا را در یکی از چند مرحله از چرخه لیتیک متوقف می سازند.
ژن هایی که مسئول بسیاری از صفات در لاکتوکوکسی ها هستند بر روی پلاسمید قرار دارند. بنابراین این امکان وجود دارد که پلاسمیدهای مربوطه از یک باکتری به باکتری دیگر منتقل شوند و یک فنوتیپ مقاوم به فاژ در نژاد دریافت کننده ایجاد کنند. پلاسمید PTRK2030 مسئول چندین مکانیسم مقاوم به فاژ می باشد.(61 ،45)
1-9- مقاومت آنتی بیوتیک:
پروبیوتیک ها میکروارگانیسم های زنده ای هستند که اگر به اندازه ی کافی استفاده شوند برای سلامتی انسان اثر مفید دارند. بسیاری از گونه های میکروبی دارای خصوصیات پروبیوتیک هستند که در این بین لاکتوباسیل ها دارای قدمت طولانی می باشد که در تولید غذاهای تخمیری و آشامیدنی ها دخیل هستند.
بیش از یک دهه است که اثر سود بخشی سویه های پروبیوتیک بر روده و سلامت انسان با گسترش مصرف غذاهای پروبیوتیک در جهان افزایش یافته است بنابراین آگاهی از ایمنی لاکتوباسیل هایی که به عنوان محصولات پروبیوتیکی استفاده می شوند ضروری است. روده انسان زیستگاه طبیعی مجموعه باکتری های دینامیکی است که ارتباط مستقیم با سلامت انسان دارند.
میکروفلور روده انسان اکوسیستم پیچیده ای است که از حدود1014 سلول باکتری که باکتروئید ها، یوباکتر، بیفیدوباکتر، رامنوکوکوس و کلستریدیوم اکثریت غالب را تشکیل می دهند، بوجود آمده است. تنوع زیادی از ژن های مقاوم به آنتی بیوتیک از میکروبیوم 40روده انسان جداسازی شده است. در صورتی که سویه های پروبیوتیک، داخل روده با میکروفلور ذاتی روده بر هم کنش کنند انتقال ژن های مقاوم به آنتی بیوتیک صورت می گیرد. گسترش ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی سبب کاهش درمان بیماران عفونی خواهد شد. این مربوط به ژن های مقاوم به آنتی بیوتیکی قابل انتقال لاکتوباسیل هاست که یا به عنوان سویه های پروبیوتیک یا استارتر در تولید غذاهای تخمیری استفاده می شود. (51) در نتیجه گسترش مقاومت
آنتی بیوتیکی در باکتری های پاتوژن سبب طولانی شدن دوره درمان می شود و همچنین هزینه های هنگفتی برای درمان این افراد صرف خواهد شد.(20) لذا در این راستا چون سویه های بومی هر منطقه نسبت به سویه های غیر بومی دارای خواص کاربردی بهتری هستند بررسی امنیت این سویه ها از اهمیت زیادی برخوردار است. (24و26)
با توجه به مطالب ذکر شده در این مطالعه به بررسی الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی 65 سویه لاکتوباسیل جداشده شده از محصولات لبنی سنتی تولید شده در مناطق جغرافیایی مختلف ایران پرداخته می شود.
بر اساس نتایج ارائه شده در کمیته بین المللی غذای اروپا41 برای ارزیابی ایمنی اسید لاکتیک باکتری ها در محصولات لبنی که به عنوان پروبیوتیک یا استارتر استفاده می شوند یکی از راه هایی که پیشنهاد میگردد تعیین پروفایل مقاومت آنتی بیوتیکی با استفاده از روش دیسک دیفیوژن است. (51)
چنانچه مقاومت ذاتی و ناشی از جهش کروموزومی باشد غیر قابل انتقال و یا اینکه میزان انتقال به قدری پایین است که قابل چشم پوشی است و در صورتی که ژن مقاومت اکتسابی باشد با نرخ قابل توجهی قابل انتقال خواهد بود که با آزمون mating انتقال ژن مقاومت می توان به آن پی برد. اگر 5-10 تا 6- 10 ژن هم یوغی شود و انتقال پیدا کند آن سویه معمولا برای محصولات میکروبیال استفاده نخواهد شد .(51)

1-9-1- مقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل های پروبیوتیک:
مقاومت به آنتی بیوتیک مشکلی است که به طور جهانی افزایش پیدا کرده است که ناشی از فشار های انتخابی42 استفاده از آنتی بیوتیک است.(50)

فشار های انتخابی:
استفاده به عنوان شیمی درمانی
استفاده معدود مجموعه ی آنتی میکروبیال ها برای انسان
استفاده نابجا و سوء استفاده از آنتی بیوتیک ها برای درمان انسان
استفاده از آنتی بیوتیک ها در کشاورزی و استفاده نابجا از آن ها
استفاد از آنتی بیوتیک های ضعیف
پراکندگی میکروارگانیسم های مقاوم
عدم کنترل کافی در مراقبت های بهداشت
فقدان نظارت و در نهایت تاخیر در جداسازی(9)
بسیاری از محصولات غذائی توسط فرایند های تخمیری باکتری ها لاکتیک اسید بوجود می آیند. مشکل جدی انتقال ژن های مقاوم به سویه های پروبیوتیک است.
از لحاظ ایمنی مقاومت آنتی بیوتیکی ذاتی و اکتسابی باید قابل تمیز باشند.
1-9-2- انواع مقاومت آنتی بیوتیک
مقاومت آنتی بیوتیکی به دو صورت است:
مقاومت طبیعی : یک ویژگی اساسی گونه های باکتری بوده و تمامی افراد یک گونه را شامل می شود و بستگی به مواجهه قبلی با آنتی بیوتیک ندارد. این نوع مقاومت ناشی از وضعیت فیزیولوژیک، بیوشیمیایی یا مورفولوژیک ذاتی و خاص باکتری است که مانع از اثرات آنتی بیوتیک می شود. تشخیص این مقاومت آسان است بطوری که در مواجهه کم ارگانسیم، با آنتی بیوتیک مشخص می گردد.
مقاومت اکتسابی: مقاومتی است که قبلا نسبت به دارو حساس بوده و در مواجهه قبلی مقاوم شده است. این مواجهه باعث ایجاد فشارهای انتخابی می شود که موجب رشد بیش از حد و سریع سلول های مقاوم و ظهور یکسری سلول های مقاوم می گردد. (32)

1-9-3- انتقال افقی ژن های لاکتوباسیل های پروبیوتیک:
پروبیوتیک ها به انتقال ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی به باکتری های کامنسال روده یا پاتوژن های حاضر در روده کمک می کنند. حضور ژن های مقاوم به آنتی بیوتیک قابل انتقال در میکروفلور روده یک پدیده ناخواسته است که این خطرات، بالقوه توسط حضور پاتوژن ها در روده و درمان آنتی بیوتیکی ناقص بدست می آید.
عناصر خارج کروموزومی مانند پلاسمید های کانجوگیتیو و ترانسپوزون ها ژن های مقاومت به آنتی بیوتیک را در لاکتوباسیل ها انتقال می دهند. انتقال از لاکتوباسیل ها به باکتری های کامنسال دیگر در شرایط Invitro صورت می گیرد. (51)
3 مکانسیم برای انتقال افقی ژن ها وجود دارد:
کانجوگیشن (هم یوغی) : اغلب برای انتقال مقاومت به میکروب های گاستروانتریت با اهمیت است. این مکانیسم توسط عناصر ژنتیکی متحرک 43 مثل پلاسمید و ترانسپوزون از یک باکتری زنده، توسط تونل های پروتئینی که موقتا به باکتری متصل شده به باکتری دیگر انتقال پیدا می کند. در باکتری های گرم منفی توسط پیلی های جنسی در حالی که در باکتری ها ی گرم مثبت توسط ساختارهای سطحی سلول این انتقال صورت می گیرد.
ترانس فورمیشن: ساده ترین روش انتقال است که در آن، DNA رها شده از یک باکتری توسط باکتری دیگر برداشته می شود.
ترانسداکشن: مکانسیم انتقال DNA از یک باکتری به باکتری دیگر که با واسطه ی باکتریوفاژ صورت می گیرد. ترانسداکشن فراوانی زیای در رودخانه ها، آب دربا و خاک دارد. دو نوع مکانسیم ترانداکشن وجود دارد:
ترانداکشن عمومی44 :ذرات درون DNA سر باکتریوفاژ بسته بندی شده است. برخی از تراسداکشن های باکتریوفاژ فقط کروموزومال یا DAN پلاسمیدی است وهیچ DNA باکتریوفاژی وجود ندارد. در حالی که برخی دیگرDNA باکتریوفاژ و DNAخارجی است. اندازه سر باکتریوفاژ تعیین کننده مقدار DNA که می تواند درون سر بسته بندی شود و توسط ترانسداکشن انتقال پیدا می کند.
ترانسداکشن خصوصی45: یک یا چند ژن باکتریوفاژ توسط DNA باکتریایی میزبان جایگزین می شود و انتقال پیدا می کند. (50، 8 )
1-9-4- عوامل ضد باکتریایی
1-9-4-1- آنتی بیوتیک ها:
آنتی بیوتیک ها ترکیباتی هستند که توسط میکروارگانیسم های مختلف تولید می شود و در نتیجه سبب مرگ یا توقف رشد باکتری ها می شود. فلمینگ اولین کسی بود که متوجه شد قارچ پنی سیلیوم از تکثیر استافیلوکوک ها جلوگیری می کند. کنسانتره ای از کشت این قارچ تهیه شده و فعالیت قابل توجه ضد باکتریال و فقدان سمیت اولین آنتی بیوتیک یعنی پنی سیلین نشان داده شده است. (63)
آنتی بیوتیک ها به چند دسته تقسیم می شوند: پنی سیلین ها، سفالوسپورین ها، تتراسایکلین ها، آمینوگلیکوزیدها، فلوروکینولونها، ماکرولیدها و سولفونامیدها از مهمترین آنها هستند.
1-9-5- مکانیسم آنتی بیوتیک ها:
مهار سنتز دیواره سلول
مهار سنتز غشاء سلول
موثر بر سیتوپلاسم
آنتی بیوتیک ها ی موثر بر مسیر متابولیسمی
مهار کننده سنتز پروتئین
مهار سنتز اسید نوکلوئیک

جدول1-2: گروه های آنتی بیوتیک و مکانیسم عمل آن ها
مهارکنندگی آنتی بیوتیک
گروه ها
آنتی بیوتیک

آنتی بیوتیک های مهارکننده سنتز دیواره سلول

بتالاکتام

آموکسی سیلین
آمپی سیلین
پنی سیلسین

گلیکو پپتیدها
ونکومایسین

آنتی بیوتیک های مهار کننده سنتز پروتئین
مهارکننده زیر واحد 30s
آمینوگلیکوزیدها

جنتامایسین
نئو مایسین
کانامایسین
استرپتومایسین

مهار کننده زیر واحد 50s
کلرامفنیکل
تتراسایکلین
ماکرولید ها
لینکوزامید

کلرامفنیکل
تتراسایکلین
اریترومایسین
کلیندامایسین

مترونیدازول
فلوروکینولون

مهارکننده سنتزDNA

آنتی بیوتیک های مهار

Posted in پایان نامه ها

منبع پایان نامه ارشد درمورد محصولات لبنی، بیوتکنولوژی، استراتژی ها

اندازه کوچک
B1
سیفوویریده ها
C2,bIL67
دم دراز غیر قابل انقباض
سر دراز
B2

JCL1032
دم دراز غیر قابل انقباض
سر باریک
B3

PO34, KSY1
دم غیر قابل انقباض کوچک
C
پدوویریده ها

گروه B رایج ترین نوع آن هاست که باکتری های اسید لاکتیکی را آلوده می کند. (61)
1-8-7- مراحل ورود و تکثير باکتريوفاژ:
همانگونه که در تحقيقات ديگر نظير تحقيقي که دوخسن 27 و همکاران بر روي کنترل باکتريوفاژهاي لاکتوکوکال يا تحقيقي که توسط اليس28 و دلبروک 29 در مورد رشد داخل و خارج سلولي باکتريوفاژها انجام دادند، مشخص شد مراحل ورود و تکثير باکتريوفاژها بصورت زير است: (63)
1-8-7-1- مرحله جذب فاژ بر روي سلول باکتري:
در فاژهاي دم دار، زوايد دم در چسبيدن فاژ بر روي سلول باکتري نقش دارند. البته فعاليت ليزوزم ها براي بوجود آوردن سوراخ يا نقطه اي در روي ديواره باکتري نيز ضروري است. در فاژهاي بي دم بعضي از کپسومرهاي موجود در روي کپسيد فاژ اين عمل را انجام مي دهند. براي انجام عمل جذب در محيط حاوي باکتري و فاژ اختصاصي آن، وجود املاحي نظير کلريد کلسيم يا کلريد سديم الزامي است.

1-8-7-2- مرحله ورود فاژ به داخل باکتري:
در فاژهاي دم دار با غلاف کوتاه شونده اسيد نوکلئيک داخل کپسيد، با کوتاه شدن غلاف روي دم و ورود قسمتي از دم به ديواره باکتري، از راه کانال ايجادشده وارد باکتري مي شود . بر خلاف ويروس هاي حيواني و انساني فقط اسيد نوکلئيک وارد شده و بقيه زوائد مانند مرحلة غيرپوشش 30 در تکثير ساير ويروسها، در خارج از سلول باکتري باقي مي مانند بدين معنا که خروج اسيد نوکلئيک فاژ از کپسيد آن، ضمن ورود آنها به داخل باکتری صورت می گیرد.
1-8-7-3- بیوسنتز:
در اين مرحله اسيد نوکلئيک فاژ کليه اعمال سنتز را خود بر عهده گرفته و اين اعمال را در باکتری کنترل می کند. اولmRNA و پروتئینهای اولیه را سنتز می کند که این ها خاصیت آنزیماتیکی دارند و برای ساخته اسید نوکلوئیک جدید به کار می روند و پس از آن mRNA و پروتئین های ثانویه را سنتز می کنند که در ساختمان فاژهای جدید به کار خواهند رفت.
1-8-7-4- رسیدگی کامل:
در اين مرحله اسيد نوکئيک توليد شده به حالت فشرده درآمده و توسط کپسومرها احاطه مي شود و بالاخره کپسيد تشکيل شده و در داخل آن قرار مي گيرد همزمان با اين اعمال دم فاژها نيز ساخته مي شود و در روي کپسيد بر محل هاي مخصوص به خودشان مي چسبند و آرام آرام فاژهاي جديد تشکيل مي شود.

1-8-8- منشا فاژ:
با وجودي که در مورد ارتباط بين فاژهاي مختلف اطلاعات زيادي بدست آمده ولي هنوز منشا فاژ مورد بحث مي باشد. دو خط سير مهم براي آلودگي فاژ در تاسيسات لبني مشخص شده است : آغازگر ليزوژنيک و حضور باکتريهاي اسيد لاکتيک در شير خام.
1-8-9- سیکل حیاتی باکتریوفاژ:
سيكل فساد سلولي توسط فاژ، با جذب سطحي آن بر روي ديواره سلولي مربوط به باکتری های حساس میزبان فاژها در حالت کلي دو سيکل حياتي ليتيک و ليزوژنيک دارند.(شکل4)(56)
1-8-9-1 سیکل لیتیک:
در اين سيکل فاژها پس از ورود به داخل باکتري حساس به خود، تکثير يافته و همانندسازي مي کند و باکتري را در نهايت ليز مي کنند. ليز شدن باکتري بدين صورت انجام مي گيرد که از طرف ژنوم فاژ يک پروتئين ليزکننده بيشتر مي شود و اين پروتئين، ديواره باکتري را از داخل از بين مي برد و ديواره را متلاشي مي کند لذا فاژهاي تشکيل يافته جديد بيرون مي ريزند که در اين حالت به آنها فاژ فرزند31 مي گويند که در تماس با باکتري جديد به آن مي چسبند و اين سيکل دوباره تکرار مي شود. عموما باکتريوفاژهاي لبني از اين سيکل پیروی مي کنند و به اين فاژ، فاژ فعال32 نيز گفته مي شود.
1-8-9-2- سیکل لیزوژنیک:
اين فاژها بصورت معتدل 33 زندگي مي کنند بدين معني که بعد از ورود به باکتري، رشد و تکثير نيافته و باکتري را ليز نمي کنند. بلکه فاژ پس از اتصال به ديواره سلولي باکتري، ژنوم خود را وارد سلول باکتري مي نمايد. ژنوم فاژ به ژنوم باکتري چسبيده، ادغام شده و همراه رونويسی34 ژنوم باکتری با کروموزوم آن تقسیم شده و به نسل های بعدی منتقل می شود و به نام پروفاژ35 معروف است و به این عمل لیزوژنیک می گویند. اين نوع فاژ، فاژ معتدل نيز ناميده مي شود.

شکل 1-4- سیکل حیاتی لیتیک و لیزوژنیک باکتریوفاژ

1-8-10- روش های جداسازی فاژ
2 نوع روش جداسازی فاژ وجود دارد : روش مستقیم و غیر مستقیم

1-8-10-1- روش مستقیم:
روش جداسازی مستقیم بر روی حضور ذرات فاژ لیتیک یا ترکیبات آن ( DNA و پروتئین ) تمرکز می کند.
1-8-10-1-1- روش های میکروبیولوژی:
روش های استاندارد میکروبیولوژی عبارتند از : سنجش پلاک، تست لکه 36و تست های فعالیت که معمولا برای شیر یا محصولات تخمیری انجام می شود. یکی از مزیت های این نوع تکنیک تشخیص مهار کننده های فاژی و غیر فاژی است. ضعف این روش این است که به سویه های اندیکاتور حساس است و دیگر اینکه زمان نسبتا طولانی برای بدست آوردن نتایج لازم است.(49)
1-8-10-1-2- روش مولکولی:
جداسازی مولکولی روشی مقدم و اختصاصی است بدلیل اینکه این نوع سنجش در مدت زمان کوتاهتر از روش های دیگر انجام می گیرد. چندین روش پایه ای PCR طراحی شده است و در جداسازی موفقیت آمیز بوده و حتی برای طبقه بندی فاژهای لاکتوباسیل، لاکتوکوکوس ها و استرپتوکوکوس ها در مخلوط های لبنی که شامل آب پنیر، استارتر های آب پنیر و نمونه های شیر است مورد استفاده قرار می گیرد.
محدودیت جداسازی روش یک مرحله ای PCR کلاسیک معمولا 1104-10 7PFU.ml- می باشد.
این روشی، روشی با حساسیت بالا و سریع می باشد. در مطالعات اخیر این متد برای جداسازی و شمارش سه گروه فاژ لاکتوکوک به نام های C2, P335,936 که از شیر خام بز و پنیر با محدودیت جداسازی پایین 102 PFU.ml-1 و در حدود دو ساعت به طول انجامیده استفاده شده است.
روش مولکولی ذرات فاژ فعال و غیر فعال را تشخیص می دهد از این حیث کهDNA فاژ را جداسازی
می کند. تکنیک جداسازی مولکولی برای آزمایشات روتین مقرون به صرفه نیست و اختصاصی عمل
می نماید. این روش فقط فاژهایی را که سکانس ژنومیک آنها در دسترس باشد جداسازی می کند، چون بر پایه ی جداسازی DNAمی باشد.
1-8-10-2- روش های غیر مستقیم سنتی:
1-8-10-2-1- تست فعالیت
تست فعالیت یک ابزار عمومی برای انالیز روتین در کارخانه های لبنی می باشد. حضور فاژ در محصولات لبنی ( در مقایسه با نمونه های کنترل شده فاقد فاژ ) سبب کاهش تولید اسید می شود.
اهمیت محدودسازی برای این سنجش ها به خصوص برای آغازگرهای مخلوط چند سویه باید در نظر گرفته شوند چون سویه هایی که به فاژ غیر حساس هستند به رشد و اسیدی شدن ادامه می دهند.
1-8-10-2-2- تست اندیکاتور
اگر فاژ در نمونه باشد تاخیر یا شکست در تغییر رنگ ( عمدتا متیلن بلو یا برموکرزول پرپل) مشاهده می شود. همانطور که در تست فعالیت ممکن است حضور فاژ نتایج منفی کاذب را بدهد در تست اندیکاتور نیز نتایج منفی کاذب را نیز خواهیم داشت.(49)
1-8-10-2-3- فلوسایتومتری37
در چندین سال گذشته برای جداسازی ویروس ها از آب دریا استفاده شده است. در این روش اسید نوکلوئیک را رنگ آمیزی می کنند و فاژهای آزاد موجود در نمونه بدون توجه به میزبان آن ها قابل شمارش است.
اخیرا جداسازی فاژهای لاکتوکوک آلوده کننده از طریق روش فلوسایتومتری گزارش شده است محدوده جداسازی این روش PFU.ml -1 105 می باشد که باروش PCR کلاسیک قابل مقایسه است.
در این روش ذرات بزرگ مانند سلول های یوکاریوتیک و ذرات چربی باید برداشته شوند تا از بلوکه شدن فلوسایتومتری جلوگیری شود.(49 ،6)
1-8-10-2-4- امپدانس الکتریکی یا رسانایی شیر
آلودگی فاژ سبب کاهش تولید اسید لاکتیک در شیر خواهد شد. در مطالعه اخیر Garcio-Aljaro و همکارانش روش جداسازی سریع را که بر اساس تغییرات امپدانس میزبان روی میکروالکترود فلزی (پلاتین و طلا) است، مورد مطالعه قرار دادند. آلودگی و پیامد لیز سلول میزبان توسط اسپکتروسکوپی، امپدانس غیر فاراد در نمونه های شیر مورد سنجش قرار گرفت. سادگی این روش از مزیت های آن است.
اخیرا ترکیب روش میکروسکوپی epiflurecence و میکروسکوپی Atomice force (AFM) برای سنجش حضور فاژها گزاررش شده است.
با استفاده از روش میکروسکوپی epiflurecence ذرات فاژ لاکتوباسیلوس هلوتیکوس شمارش شده است در حالی که روش میکروسکوپی AFM به سنجش و بررسی تغییر در فاژ و جمعیت های باکتریایی در طی مراحل آلودگی می پردازد.
ذرات فاژ توسط SYBR GreenI رنگ آمیزی می شود و سپس نور سبز ساطع می شود در نتیجه ذرات درخشان بزرگتر از اندازه واقعی ویریون دیده می شوند و با میکروسکوپ فلورسنس قابل شمارش هستند. معایب این روش بدین صورت است که ذرات فاژ ویرولانت و غیر ویرولانت هر دو شمارش می شوند.

1-8-10-2-5- سنجش پلاک/ لکه و رشد/ تاریکی38
این دو روش به طور دائم مورد استفاده قرار می گیرد. این سنجش بر اساس مهار رشد سویه های میزبان توسط باکتریوفاژ صورت می گیرد. کاهش تولید اسید لاکتیک سبب کاهش رشد سویه های میزبان می شود.
گرچه روش های تشخیص میکروبیولوزی از نظر اقتصادی مقرون به صرفه است اما دارای خصوصیات نامطلوب هم می باشد.
این فرایندها در مدت زمان طولانی صورت می گیرد، حداقل 24 ساعت زمان لازم است همچنین باکتریوفاژها دارای میزبان اختصاصی هستند و یک فاژ یک یا تعداد کمی از سویه های باکتری را آلوده می کند و برای انجام این تست ها مجبور به حفظ گروه بزرگی از باکتری های اسید لاکتیک هستیم علاوه بر این به نتایج منفی حاصل از این تست ها هیچ اطمینانی نیست که الزاما فاقد فاژ باشند.
این نقاط ضعف باعث بوجود آمدن روش میکروبیولوژی کلاسیک همانند39 PCRکه با حساسیت بالا و سریع تر از روش های میکروبیولوژی دیگر قابل اجراست، خواهد شد.

1-8-10-2-6- انواع PCR
1-8-10-2-6-1- Mutiplex PCR
در این روش حضور بیش از یک نوع فاژ مورد بررسی قرار می گیرد. در سال 2000 labrie, Moineau این روش را طراحی کردند تا تنها توسط یک واکنش مجرد حضور 3 گونه فاژ لاکتوکوکوس لاکتیس تشخیص داده شود.
1-8-10-2-6-2- Quntitive PCR (q PCR)
ذرات فاژ را در نمونه سریع تر و حساس تر از pcr سنتی شناسایی می کند. این روش حضور فاژ را به صورت روتین در محصوات لبنی شناسایی می کند و همچنین استراتژی های کنترل آلودگی به فاژ را شامل می شود. این روش به شناسایی مستقیم فاژ حتی در مقادیر کم نمونه های صنعتی نیز می پردازد همچنین این روش، روشی کیفی می باشد.
1-8-10-2-6-3- Traditional PCR
یک تکنیک بیولوژی –مولکولی است که به طور وسیع استفاده می شود. در سال 1983 توسط کری مولیس و همکارانش این روش توسعه یافته است در این روش یک یا تعداد کمی کپی از ذرات DNA اختصاصی در نمونه توسط DNA پلی مراز تقویت می شود و در یک سیکل حرارتی 235 کپی یا بیشتر در مدت زمان کوتاه تولید می شود. در انتها واکنش تقویت شده روی ژل آگارز آنالیز شده و ذرات DNA بر اساس اندازه ژنوم جدا می شوند. این تکنیک برای شناسایی فاژ در نمونه های شیر ، آب پنیر در کارخانه ها یا حتی نمونه های هوا استفاده می شود و مقادیری حدود 104-103 ذره فاژ در لیتر را جداسازی می کند.

1-8-11- کنترل فاژ
از زمانی که مشکل فاژ برای اولین بار تشخیص داده شد تولیدکنندگان و دانشمندان راهبردهای مختلفی را برای جلوگیری و یا حداقل کاهش ابتلا به فاژها ارائه داده اند.
بواسطه ی پیشرفت در بیولوژی مولکولی و بیوتکنولوژی توسط افرادی در استرالیا، نیوزلند، هلند، انگلستان، آمریکا و سوئیس در طی دو قرن گذشته تحقیقات بر روی باکتریوفاژ به سطح قابل قبولی رسیده است و از این برنامه های تحقیقاتی راهبردهای کنترلی زیادی بدست آمده است. قبل از پرداختن به این روش ها لازم به ذکر است که از محیط تکثیر کشت آغازگر، مکان تولید پنیر که بخوبی استریل شده باشند و نقاط ورودی فاژ که تا حد امکان محدود شده باشند، اطمینان حاصل