حساسیت نسبت به آنتی بیوتیک
در این مطالعه تعیین حساسیت نسبت به 22 گروه آنتی بیوتیک شامل پنی سیلین ها، سفالوسپورین ها، آمینوگلیکوزید ها، گلیکوپپتید ها، ماکرولیدها، لینکوزامیدها، تتراسایکلین ها، کینولون ها و دیگر آنتی بیوتیک ها نظیر کلرامفنیکل، نیتروفورانتوئین، کوتریماکسازول و میتومایسینC با استفاده از روش دیسک دیفیوژن نسبت به این آنتی بیوتیک ها انجام گردید. در این روش از معیارهای CLSI استفاده شده است
جدول 3-3- دیسک های انتی بیوتیک مورد استفاده جهت آنتی بیوگرام در این مطالعه
K- 30µg
TOB- 10µg
GM- 10µg
S- 10µg
کانامایسین
توبرامایسین
جنتامایسین
استرپتومایسین
آمینوگلیکوزید ها

CF- 30µg

CRO- 30µg
Ctx-30µg
سفالوتین : نسل اول

سفتریاکسون، سفوتاکسیم :نسل سوم

سفالوسپورین ها
V- 30µg
ونکومایسین

گلیکوپپتیدها
CC- 2µg
کلیندامایسین

لینکوزامید ها
E- 15µg
اریترومایسین
ماکرولیدها
AM- 10µg
P- 10µg
ME- 5µg
OX- 1µg
آمپی سیلین
پنی سیلین
متی سیلین
اگزاسیلین
پنی سیلین ها
CP- 5µg
NA-30µg
OFX-5µg
سیپروفلوکساسین
نالیدیکسیک اسید
آفلوکساسین
کینولون ها
SXT-1.25/23.75µg

کوتریماکسازول
سولفانامید ها
TE-30µg
تتراسایکلین

تتراسایکلین ها
C-30µg
MTC-5µl
FM-300µg
کلرامفنیکل
میتومایسین C
نیتروفورانتوئین
دیگر انتی بیوتیک ها

3-7-1- آزمایش تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش انتشار دیسک در آگار (دیسک دیفیوژن)
ازمایش دیسک دیفیوژن که روش کربی بائر نیز نامیده می شود، از سال 1996 در آزمایشگاه ها به طور وسیعی مورد استفاده قرار گرفت. اغلب آزمایشگاه ها برای تعیین حساسیت انتی بوتیکی از این روش و بر طبق استانداردهای CLSI استفاده می کنند. عوامل اصلی این ازمایش عبارتند از: دیسک های حاوی آنتی بیوتیک، محیط کشت مناسب و سوسپانسیون باکتریایی که هر یک بایستی مطابق استاندارد های CLSI فراهم شوند. (8)
3-7-2-1- روش انجام آزمایش دیسک گذاری
3-7-2-1-1- تهیه محیط کشت
در این آزمون از محیط کشت MRS آگار برای سویه های لاکتوباسیل استفاده شد. این محیط ها بر اساس دستور کارخانه سازنده تهیه و PH آن کنترل می شود. سپس محیط اتوکلاو واستریل می شود و در پلیت ها ریخته شده و صبر می کنیم تا پلیت ها خنک شده و این محیط ها تا یک هفته در یخچال قابل نگه داری هستند. برای کنترل الودگی برخی از این پلیت ها به طور تصادفی جدا و به مدت 24 ساعت در 37-35 درجه سانتی گراد انکوبه شدند.(8)
3-7-2-1-2- روش کار
ابتدا یک کشت تازه 18-24 ساعته برای تمامی سویه ها جمع آوری شده تهیه شد سپس سوسپانسیون میکروبی معادل نیم مک فارلند ساخته شد. سپس یک درصد محیط کشت داخل پلیت سوسپانسیون میکروبی را با سمپلر برداشته و داخل پلیت ریخته سپس با سواپ استریل روی سطح محیط MRS آگار کشت داده ( به صورت سه مرحله ای) و بعد از گذشت 15 دقیقه از تلقیح، دیسک های آنتی بیوتیک را روی آن قرار داده می شوند. لازم به ذکر است که دیسک ها یک ساعت قبل از استفاده بایستی در دمای اتاق قرار گیرند. بعد از گذشت 15 دقیقه از قرار دادن دیسک ها ، پلیت ها درون جار بی هوازی در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 24-18 ساعت انکوبه گردیدند. قطر هاله ها با کولیس اندازه گیری و تفسیر آن با توجه به جدول CLSI انجام می گیرد. ما در این مطالعه به بررسی حساسیت و مقاومت سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به آنتی بیوتیک میتومایسینC پرداختیم بدین صورت که محلولی با غلظت 2/0 میکروگرم بر میلی لیتر تهیه کرده و 5 میکرولیتر از این محلول را در کنار بقیه دیسک های آنتی بیوتیک قرار داده و قطر هاله های آن را نیز با کولیس اندازه گیری کرده ایم.

شکل3-2 – اندازه گیری هاله های عدم رشد

فصل چهارم
نتایج

4-1- شرح مختصری از مطالعه
در این پژوهش به بررسی میزان فاژهای لاکتوباسیل و مقایسه ی 3 روش مختلف، روش دولایه ای آگار، القاء با اشعه ی UV و آزمون هیپ و لورنس برای جداسازی فاژها پرداخته می شود. پروفایل حساسیت آنتی بیوتیک باکتری های اسید لاکتیک در بسیاری از کشورها ثبت شده است.(46 ، 17، 5) لذا در این مطالعه به بررسی پروفایل حساسیت آنتی بیوتیک سویه های لاکتوباسیل جمع آوری شده بر روی 22 گروه مختلف آنتی بیوتیک متشکل از آمینوگلیکوزیدها ( کانامایسین، توبرامایسین، جنتامایسین، استرپتومایسین)، سفالوسپورین ها ( سفالوتین: نسل اول، سفتریاکسون و سفاتوکسیم: نسل سوم)، گلیکوپپتید ها (ونکومایسین)، لینکوزامید ها (کلیندامایسین) ، ماکرولیدها (اریترومایسین)، پنی سیلین ها ( آمپی سیلین، پنی سیلین، اگزاسیلین، متی سیلین) کینولون ها ( سیپروفلوکساسین، آفلوکساسین، نلیدیگسیک اسید )، سولفانامید ها (کوتریماکسازول) ، تتراسایکلین و دیگر آنتی بیوتیک ها که شامل کلرامفنیکل، نیتروفورانتوئین و میتومایسین C پرداخته شد.
4-2- نتایج
سویه های لاکتوباسیل جداسازی شده از مناطق مختلف جغرافیایی ایران موجود در سازمان پژوهش های علمی و صنعتی ایران (گروه بیوتکنولوژی) نگه داری شده است مورد استفاده قرار گرفت.

4-2-1- نتایج حضور یا عدم حضور فاژ در سویه ها
جدول 4-1- نتایج حضور یا فقدان فاژ در سویه ها با استفاده از 3 روش مختلف
PH بعد از 24 ساعت
PH بعد از 7:30 دقیقه
UV
MTC
سویه ها
4/58
5/35

(
12C
3/53
6/02

(
10d2
3/76
5/88

(
7C
4/73
6/15

(
6a
5
5/82


12d
3/61
5/38

(
10d1
6/30
6/28

(
6b
3/67
6/02

(
G8
3/68
5/92

(
5b
3/64
5/48

(
H2b
3/66
5/66

(
H4a
3/65
5/07
(
(
H4
4/73
5/49

(
1C
5
6/31

(
b2
6/22
6/24

(
مات Tkch
4/73
5/49

(
مات TSD
6/37
6/52

(
مات TLD
5/96
6/56

(
مات TLch
4/54
6/14

(
سفید TSD
6/24
6/12


نمدی TLY
4/85
5/77


خامه ای TShs21
4/56
6/14

(
سفید Thch
5/33
6/17

(
سفید Tlch
6/49
6/50

(
مات Tlch1
6/34
6/46

(
مات Tlch2
6/43
6/56

(
مات Tlch3
4/83
5/80


سفید TLD
5/01
6/14

(
TLD1
5/70
6

(
TLD2
5/16
6/28

(
TLD3
5/78
6/04

(
7-1
6/16
6/27

(
11-3
4/62
5/80


12-1
5/13
5/75


8-1
5/58
6/01

(
7-4
5/58
5/97


11-1-1
5/63
5/97

(
5-2
6/39
5/45
(
(
22a
4/04
5/64
(
(
9b1
4/17
6/17


22c
4/60
5/92


2-1
4/71
5/49
(
(
12b
5/68
5/95

(
11-1
4/02
5/81
(
(
22b
3/83
5/65

(
1b
5/74
5/97


11-2
5/88
5/90


کوکسی 10b1
4/95
5/95


باسیل 10b1
3/69
5/47
(
(
9a
3/75
5/42


2a
6/48
6/56

(
ASRV-1
5/40
5/65

(
ASR4
6/48
6/56

(
ASR7-1
3/57
5/75
(
(
10C
6/12
6/38
(
(
ASR1-2
5/11
5/83

(
ASR8-1
6/18
6//46
(
(
ASRS
6/47
6/48

(
AS10
6/43
6/54

(
AS10Z
6/36
6/51


ASR3
5/46
6/27
(
(
ASR1-1
6/30
6/35

(
ASR1
6/41
6/51

(
3-1
3/57
6/33

(
9b2
(( ) نشاندهنده ی مشاهده ی پلاک بااستفاده از روش ذکر شده، (- ) نشاندهنده ی عدم مشاهده پلاک
با توجه به جدول 4-1 که نشاندهنده ی وجود فاژهای لاکتوباسیل است می توان دید که از 65 سویه ی لاکتوباسیلوس با استفاده از روش دولایه ای پلاک 50 سویه، با القاء سویه ها توسط پرتویUV 10 سویه و با استفاده از آزمون Heap and Lawerence 34 سویه دارای فاژ هستند (لازم به ذکر است که PH اولیه شیر 56/6 می باشد). همانطور که در این جدول مشاهده می شود با القاء سویه ها توسط میتومایسین C تمام سویه هایی که دارای فاژ هستند با تولید پلاک قابل تشخیص هستند و تعداد کمی از سویه های دارای فاژ توسط القاء با نمایان شده اند و با القاء توسط حرارت در روش Heap and Lawerence 34 نمونه دارای فاژ هستند چون حرارت یک شوک ضعیف برای القاء فاژ می باشد و این امکان وجود دارد که تمام فاژها القاء نشوند.
4-1- نمودار نتایج مقایسه ی 3 روش مختلف برای جداسازی فاژ

4-2-2- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء UVو میتومایسینC
همانطور که در جدول 4-1 نشان داده شده است 10 سویه مشترک هستند که از هر دو روش القاء با میتومایسین (روش دو لایه ای پلاک ) و القاء با UV جداسازی شده اند، که حدود 38/15 % می باشد.
4-2-3- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء با میتومایسین C (روش دو لایه ای پلاک) و Heap and Lawerence
طبق جدول 4-1 سویه های مشترکی که از روش دو لایه ای پلاک و هیپ و لورنس جدا سازی شده 32 سویه 76/50% می باشد. اشتراک این دو روش از سایر روش ها بیشتر می باشد.
4-2-4- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء با UV و Heap and Lawerence
سویه های مشترکی که از روش القاء با UV و هیپ و لورنس جداسازی شده است 4 فاژ (15/6 %) می باشد.
4-3- نتایج حساسیت و مقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل ها
قطر هاله عدم رشد و مقایسه ی الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل ها در جدول 4-2 نشان داده شده است.

آنتی بیوتیک
ME
C
SXT
K
NA
OFX
S
AM
V
P
CC
CP
TE
FM
GM
CF
CTX
E
OX
CRO
TOB
سویه ها

5-2
68/20 S
20/28
S
0
R
0
R
0
R
0
R
0
R
97/37
S
20/18
S
30/21
I
07/9
R
84/13
I
49/32
S
32/27
S
0
R
75/28
S
69/26
S
0
R
18/22
S
26
S
0
R
22a
45/16
R
31/26
S
44/24
S
0
R
0
R
0
R
72/14
R
80/30
S
0
R
88/18
R
44/24
S
0
R
13/19
I
10
R
67/10
R
90/22
S
43/24
S
63/17
I
05/14
R
18/20
I
0
R
22c
0
R
49/25
S
13/21
S
0
R
0
R
0
R
66/16
I
25/32
S
0
R
20/14
R
68/20
S
0
R
86/21
S
24/9
R
50/10
R
32/24
S
64/25
S
66/18
I
0
R
99/26
S
.
R
2-1
75/20
S
77/26
S
34/17
I
0
R
0
R
43/12
R
0
R
25/27
S
0
R
39/26
S
45/28
S
73/14
I
01/25
S
0
R
50/12
R
26/19
R
72/23
S
13/23
S
73/16
R
55/21
S
0
R
12b
0
R
25/16
R
56/19
I
0
R
0
R
63/9
R
0
R
41/27
S
76/16
R
94/24
S
29/10
R
91/15
I
82/26
S
45/18
I
17/8
R
59/19
R
01/19
I
9
R
0
R
31/23
S
0
R
11-1
0
R
13/23
S
0
R
0
R
0
R
99/8
R
0
R
99/24
S
57/16
R
86/25
S
0
R
23/15
I
27/27
S
01/22
S
0
R
49/21
S
25
S
78/11
R
0
R
39/24
S
0
R
9b1
90/14
S
80/18
R
0
R
0
R
0
R
69 / 9 R
0
R
32
S
94/21
S
47/37
S
54/13 R
0
R
52/29
S
52/20
S
33/14
R
56/23
S
0
R
0
R
0
R
23
S
0
R
1b
0
R
57/29
S
0
R
0
R
21/18
I
0
R
06/22
S
0
R
30/26
S
64/61
S
0
R
0
R
71/27
S
37/29
S
67/14
R
0
R
0
R
81/30
S
0
R
18/14
I
0
R
11-2
05/29
S
04/30
S
0
R
0
R
0
R
0
R
0
R
81/46
S
29/25
S
20/33
S
45/14
R
98/14
I
18/35
S
94/23
S
0
R
41/25
S
41/25
S
64/12
I
62/32
S
47/32
S
0
R
10b1
35/36
S
06/35
S
41/18
I
0
R
0
R
0
R
0
R
04/43
S
23
S
32/33
S
33/13
R
78/15
I
69/36
S
04/23
S
0
R
71/30
S
71/30
S
15/11
R
47/25
S
0
R
0

دیدگاهتان را بنویسید