اندازه کوچک
B1
سیفوویریده ها
C2,bIL67
دم دراز غیر قابل انقباض
سر دراز
B2

JCL1032
دم دراز غیر قابل انقباض
سر باریک
B3

PO34, KSY1
دم غیر قابل انقباض کوچک
C
پدوویریده ها

گروه B رایج ترین نوع آن هاست که باکتری های اسید لاکتیکی را آلوده می کند. (61)
1-8-7- مراحل ورود و تکثير باکتريوفاژ:
همانگونه که در تحقيقات ديگر نظير تحقيقي که دوخسن 27 و همکاران بر روي کنترل باکتريوفاژهاي لاکتوکوکال يا تحقيقي که توسط اليس28 و دلبروک 29 در مورد رشد داخل و خارج سلولي باکتريوفاژها انجام دادند، مشخص شد مراحل ورود و تکثير باکتريوفاژها بصورت زير است: (63)
1-8-7-1- مرحله جذب فاژ بر روي سلول باکتري:
در فاژهاي دم دار، زوايد دم در چسبيدن فاژ بر روي سلول باکتري نقش دارند. البته فعاليت ليزوزم ها براي بوجود آوردن سوراخ يا نقطه اي در روي ديواره باکتري نيز ضروري است. در فاژهاي بي دم بعضي از کپسومرهاي موجود در روي کپسيد فاژ اين عمل را انجام مي دهند. براي انجام عمل جذب در محيط حاوي باکتري و فاژ اختصاصي آن، وجود املاحي نظير کلريد کلسيم يا کلريد سديم الزامي است.

1-8-7-2- مرحله ورود فاژ به داخل باکتري:
در فاژهاي دم دار با غلاف کوتاه شونده اسيد نوکلئيک داخل کپسيد، با کوتاه شدن غلاف روي دم و ورود قسمتي از دم به ديواره باکتري، از راه کانال ايجادشده وارد باکتري مي شود . بر خلاف ويروس هاي حيواني و انساني فقط اسيد نوکلئيک وارد شده و بقيه زوائد مانند مرحلة غيرپوشش 30 در تکثير ساير ويروسها، در خارج از سلول باکتري باقي مي مانند بدين معنا که خروج اسيد نوکلئيک فاژ از کپسيد آن، ضمن ورود آنها به داخل باکتری صورت می گیرد.
1-8-7-3- بیوسنتز:
در اين مرحله اسيد نوکلئيک فاژ کليه اعمال سنتز را خود بر عهده گرفته و اين اعمال را در باکتری کنترل می کند. اولmRNA و پروتئینهای اولیه را سنتز می کند که این ها خاصیت آنزیماتیکی دارند و برای ساخته اسید نوکلوئیک جدید به کار می روند و پس از آن mRNA و پروتئین های ثانویه را سنتز می کنند که در ساختمان فاژهای جدید به کار خواهند رفت.
1-8-7-4- رسیدگی کامل:
در اين مرحله اسيد نوکئيک توليد شده به حالت فشرده درآمده و توسط کپسومرها احاطه مي شود و بالاخره کپسيد تشکيل شده و در داخل آن قرار مي گيرد همزمان با اين اعمال دم فاژها نيز ساخته مي شود و در روي کپسيد بر محل هاي مخصوص به خودشان مي چسبند و آرام آرام فاژهاي جديد تشکيل مي شود.

1-8-8- منشا فاژ:
با وجودي که در مورد ارتباط بين فاژهاي مختلف اطلاعات زيادي بدست آمده ولي هنوز منشا فاژ مورد بحث مي باشد. دو خط سير مهم براي آلودگي فاژ در تاسيسات لبني مشخص شده است : آغازگر ليزوژنيک و حضور باکتريهاي اسيد لاکتيک در شير خام.
1-8-9- سیکل حیاتی باکتریوفاژ:
سيكل فساد سلولي توسط فاژ، با جذب سطحي آن بر روي ديواره سلولي مربوط به باکتری های حساس میزبان فاژها در حالت کلي دو سيکل حياتي ليتيک و ليزوژنيک دارند.(شکل4)(56)
1-8-9-1 سیکل لیتیک:
در اين سيکل فاژها پس از ورود به داخل باکتري حساس به خود، تکثير يافته و همانندسازي مي کند و باکتري را در نهايت ليز مي کنند. ليز شدن باکتري بدين صورت انجام مي گيرد که از طرف ژنوم فاژ يک پروتئين ليزکننده بيشتر مي شود و اين پروتئين، ديواره باکتري را از داخل از بين مي برد و ديواره را متلاشي مي کند لذا فاژهاي تشکيل يافته جديد بيرون مي ريزند که در اين حالت به آنها فاژ فرزند31 مي گويند که در تماس با باکتري جديد به آن مي چسبند و اين سيکل دوباره تکرار مي شود. عموما باکتريوفاژهاي لبني از اين سيکل پیروی مي کنند و به اين فاژ، فاژ فعال32 نيز گفته مي شود.
1-8-9-2- سیکل لیزوژنیک:
اين فاژها بصورت معتدل 33 زندگي مي کنند بدين معني که بعد از ورود به باکتري، رشد و تکثير نيافته و باکتري را ليز نمي کنند. بلکه فاژ پس از اتصال به ديواره سلولي باکتري، ژنوم خود را وارد سلول باکتري مي نمايد. ژنوم فاژ به ژنوم باکتري چسبيده، ادغام شده و همراه رونويسی34 ژنوم باکتری با کروموزوم آن تقسیم شده و به نسل های بعدی منتقل می شود و به نام پروفاژ35 معروف است و به این عمل لیزوژنیک می گویند. اين نوع فاژ، فاژ معتدل نيز ناميده مي شود.

شکل 1-4- سیکل حیاتی لیتیک و لیزوژنیک باکتریوفاژ

1-8-10- روش های جداسازی فاژ
2 نوع روش جداسازی فاژ وجود دارد : روش مستقیم و غیر مستقیم

1-8-10-1- روش مستقیم:
روش جداسازی مستقیم بر روی حضور ذرات فاژ لیتیک یا ترکیبات آن ( DNA و پروتئین ) تمرکز می کند.
1-8-10-1-1- روش های میکروبیولوژی:
روش های استاندارد میکروبیولوژی عبارتند از : سنجش پلاک، تست لکه 36و تست های فعالیت که معمولا برای شیر یا محصولات تخمیری انجام می شود. یکی از مزیت های این نوع تکنیک تشخیص مهار کننده های فاژی و غیر فاژی است. ضعف این روش این است که به سویه های اندیکاتور حساس است و دیگر اینکه زمان نسبتا طولانی برای بدست آوردن نتایج لازم است.(49)
1-8-10-1-2- روش مولکولی:
جداسازی مولکولی روشی مقدم و اختصاصی است بدلیل اینکه این نوع سنجش در مدت زمان کوتاهتر از روش های دیگر انجام می گیرد. چندین روش پایه ای PCR طراحی شده است و در جداسازی موفقیت آمیز بوده و حتی برای طبقه بندی فاژهای لاکتوباسیل، لاکتوکوکوس ها و استرپتوکوکوس ها در مخلوط های لبنی که شامل آب پنیر، استارتر های آب پنیر و نمونه های شیر است مورد استفاده قرار می گیرد.
محدودیت جداسازی روش یک مرحله ای PCR کلاسیک معمولا 1104-10 7PFU.ml- می باشد.
این روشی، روشی با حساسیت بالا و سریع می باشد. در مطالعات اخیر این متد برای جداسازی و شمارش سه گروه فاژ لاکتوکوک به نام های C2, P335,936 که از شیر خام بز و پنیر با محدودیت جداسازی پایین 102 PFU.ml-1 و در حدود دو ساعت به طول انجامیده استفاده شده است.
روش مولکولی ذرات فاژ فعال و غیر فعال را تشخیص می دهد از این حیث کهDNA فاژ را جداسازی
می کند. تکنیک جداسازی مولکولی برای آزمایشات روتین مقرون به صرفه نیست و اختصاصی عمل
می نماید. این روش فقط فاژهایی را که سکانس ژنومیک آنها در دسترس باشد جداسازی می کند، چون بر پایه ی جداسازی DNAمی باشد.
1-8-10-2- روش های غیر مستقیم سنتی:
1-8-10-2-1- تست فعالیت
تست فعالیت یک ابزار عمومی برای انالیز روتین در کارخانه های لبنی می باشد. حضور فاژ در محصولات لبنی ( در مقایسه با نمونه های کنترل شده فاقد فاژ ) سبب کاهش تولید اسید می شود.
اهمیت محدودسازی برای این سنجش ها به خصوص برای آغازگرهای مخلوط چند سویه باید در نظر گرفته شوند چون سویه هایی که به فاژ غیر حساس هستند به رشد و اسیدی شدن ادامه می دهند.
1-8-10-2-2- تست اندیکاتور
اگر فاژ در نمونه باشد تاخیر یا شکست در تغییر رنگ ( عمدتا متیلن بلو یا برموکرزول پرپل) مشاهده می شود. همانطور که در تست فعالیت ممکن است حضور فاژ نتایج منفی کاذب را بدهد در تست اندیکاتور نیز نتایج منفی کاذب را نیز خواهیم داشت.(49)
1-8-10-2-3- فلوسایتومتری37
در چندین سال گذشته برای جداسازی ویروس ها از آب دریا استفاده شده است. در این روش اسید نوکلوئیک را رنگ آمیزی می کنند و فاژهای آزاد موجود در نمونه بدون توجه به میزبان آن ها قابل شمارش است.
اخیرا جداسازی فاژهای لاکتوکوک آلوده کننده از طریق روش فلوسایتومتری گزارش شده است محدوده جداسازی این روش PFU.ml -1 105 می باشد که باروش PCR کلاسیک قابل مقایسه است.
در این روش ذرات بزرگ مانند سلول های یوکاریوتیک و ذرات چربی باید برداشته شوند تا از بلوکه شدن فلوسایتومتری جلوگیری شود.(49 ،6)
1-8-10-2-4- امپدانس الکتریکی یا رسانایی شیر
آلودگی فاژ سبب کاهش تولید اسید لاکتیک در شیر خواهد شد. در مطالعه اخیر Garcio-Aljaro و همکارانش روش جداسازی سریع را که بر اساس تغییرات امپدانس میزبان روی میکروالکترود فلزی (پلاتین و طلا) است، مورد مطالعه قرار دادند. آلودگی و پیامد لیز سلول میزبان توسط اسپکتروسکوپی، امپدانس غیر فاراد در نمونه های شیر مورد سنجش قرار گرفت. سادگی این روش از مزیت های آن است.
اخیرا ترکیب روش میکروسکوپی epiflurecence و میکروسکوپی Atomice force (AFM) برای سنجش حضور فاژها گزاررش شده است.
با استفاده از روش میکروسکوپی epiflurecence ذرات فاژ لاکتوباسیلوس هلوتیکوس شمارش شده است در حالی که روش میکروسکوپی AFM به سنجش و بررسی تغییر در فاژ و جمعیت های باکتریایی در طی مراحل آلودگی می پردازد.
ذرات فاژ توسط SYBR GreenI رنگ آمیزی می شود و سپس نور سبز ساطع می شود در نتیجه ذرات درخشان بزرگتر از اندازه واقعی ویریون دیده می شوند و با میکروسکوپ فلورسنس قابل شمارش هستند. معایب این روش بدین صورت است که ذرات فاژ ویرولانت و غیر ویرولانت هر دو شمارش می شوند.

1-8-10-2-5- سنجش پلاک/ لکه و رشد/ تاریکی38
این دو روش به طور دائم مورد استفاده قرار می گیرد. این سنجش بر اساس مهار رشد سویه های میزبان توسط باکتریوفاژ صورت می گیرد. کاهش تولید اسید لاکتیک سبب کاهش رشد سویه های میزبان می شود.
گرچه روش های تشخیص میکروبیولوزی از نظر اقتصادی مقرون به صرفه است اما دارای خصوصیات نامطلوب هم می باشد.
این فرایندها در مدت زمان طولانی صورت می گیرد، حداقل 24 ساعت زمان لازم است همچنین باکتریوفاژها دارای میزبان اختصاصی هستند و یک فاژ یک یا تعداد کمی از سویه های باکتری را آلوده می کند و برای انجام این تست ها مجبور به حفظ گروه بزرگی از باکتری های اسید لاکتیک هستیم علاوه بر این به نتایج منفی حاصل از این تست ها هیچ اطمینانی نیست که الزاما فاقد فاژ باشند.
این نقاط ضعف باعث بوجود آمدن روش میکروبیولوژی کلاسیک همانند39 PCRکه با حساسیت بالا و سریع تر از روش های میکروبیولوژی دیگر قابل اجراست، خواهد شد.

1-8-10-2-6- انواع PCR
1-8-10-2-6-1- Mutiplex PCR
در این روش حضور بیش از یک نوع فاژ مورد بررسی قرار می گیرد. در سال 2000 labrie, Moineau این روش را طراحی کردند تا تنها توسط یک واکنش مجرد حضور 3 گونه فاژ لاکتوکوکوس لاکتیس تشخیص داده شود.
1-8-10-2-6-2- Quntitive PCR (q PCR)
ذرات فاژ را در نمونه سریع تر و حساس تر از pcr سنتی شناسایی می کند. این روش حضور فاژ را به صورت روتین در محصوات لبنی شناسایی می کند و همچنین استراتژی های کنترل آلودگی به فاژ را شامل می شود. این روش به شناسایی مستقیم فاژ حتی در مقادیر کم نمونه های صنعتی نیز می پردازد همچنین این روش، روشی کیفی می باشد.
1-8-10-2-6-3- Traditional PCR
یک تکنیک بیولوژی –مولکولی است که به طور وسیع استفاده می شود. در سال 1983 توسط کری مولیس و همکارانش این روش توسعه یافته است در این روش یک یا تعداد کمی کپی از ذرات DNA اختصاصی در نمونه توسط DNA پلی مراز تقویت می شود و در یک سیکل حرارتی 235 کپی یا بیشتر در مدت زمان کوتاه تولید می شود. در انتها واکنش تقویت شده روی ژل آگارز آنالیز شده و ذرات DNA بر اساس اندازه ژنوم جدا می شوند. این تکنیک برای شناسایی فاژ در نمونه های شیر ، آب پنیر در کارخانه ها یا حتی نمونه های هوا استفاده می شود و مقادیری حدود 104-103 ذره فاژ در لیتر را جداسازی می کند.

1-8-11- کنترل فاژ
از زمانی که مشکل فاژ برای اولین بار تشخیص داده شد تولیدکنندگان و دانشمندان راهبردهای مختلفی را برای جلوگیری و یا حداقل کاهش ابتلا به فاژها ارائه داده اند.
بواسطه ی پیشرفت در بیولوژی مولکولی و بیوتکنولوژی توسط افرادی در استرالیا، نیوزلند، هلند، انگلستان، آمریکا و سوئیس در طی دو قرن گذشته تحقیقات بر روی باکتریوفاژ به سطح قابل قبولی رسیده است و از این برنامه های تحقیقاتی راهبردهای کنترلی زیادی بدست آمده است. قبل از پرداختن به این روش ها لازم به ذکر است که از محیط تکثیر کشت آغازگر، مکان تولید پنیر که بخوبی استریل شده باشند و نقاط ورودی فاژ که تا حد امکان محدود شده باشند، اطمینان حاصل

دیدگاهتان را بنویسید