دانلود فایل: دانلود پروژه رشته کشاورزی درباره خانواده گلسرخیان – قسمت سوم

دانلود پایان نامه

-7-1- چگونگي ايجاد ميكروستلايت‌ها

مهمترين عامل در توليد ريزماهواره‌ها موتاسيون در تعداد واحدهاي تكرار شونده از طريق عدم جفت‌شدن ناشي از لغزش در طول رشته[1] و يا خطاهاي همانند سازي DNA، یاد شده می باشد. گاهي DNA پلي‌مراز در طول همانندسازي در نواحي تكرار شونده سر مي‌خورد و باعث تغيير در تعداد واحد تكرار شونده مي‌گردد. در حقيقت سرخوردن DNA پليمراز در طول نواحي تكراري باعث عدم جفت‌شدن كامل دو رشته DNA گشته و در نهايت حلقه‌هايي در رشته الگو يا رشته جديد ايجاد مي گردد. اگر نتيجه همانندسازي ايجاد واحدهاي تكرارشونده اضافي باشد، حلقه در رشته جديد به وجود مي‌آيد ولي اگر نتيجه همانندسازي كاهش در واحدهاي تكرار شونده باشد، حلقه در رشته الگو تشكيل خواهد گردید (12).

نکته مهم : برای بهره گیری از متن کامل پژوهش یا مقاله می توانید فایل ارجینال آن را از پایین صفحه دانلود کنید. سایت ما حاوی تعداد بسیار زیادی مقاله و پژوهش دانشگاهی در رشته های مختلف می باشد که می توانید آن ها را به رایگان دانلود کنید

6-7-1- خصوصيات نشانگرهاي SSR

نشانگرهاي SSR خاص يك مكان ژني مي‌باشند و به صورت هم بارز توارث مي‌يابند. اين نشانگرها علاوه بر تنوع آللي بالايي كه نشان مي‌دهند، در كل ژنوم نيز پراكنده شده‌اند. اگرچه هزينه بهره گیری از اين نوع نشانگرها زياد می باشد ولي به واسطه پتانسيل بالاي آنها در تشخيص پلي مورفيسم و هتروزيگوسيتي در گونه های موجودات زنده به فراواني بهره گیری مي شوند (17).  هر چند كه ريز ماهواره‌هاي هر موجودي اختصاصي می باشد ولي توالي‌هاي احاطه‌كنده توالي‌هاي تكراري در گونه‌هاي خويشاوند حفظ شده مي‌باشد. از اينرو آغازگرهاي طراحي شده براي يك گونه قابل بهره گیری در گونه‌هاي خويشاوند هستند (10).  در SSR نيز مانند نشانگرهاي AFLP مي‌توان از فرايند چند تركيبي بهره برد. بدين ترتيب تكثير همزمان[2] مكانهاي ژني چند گانه در يك PCR صورت مي‌گيرد. چند تركيبي همچنين مي‌تواند به صورت تركيب قطعات آللي بيش از يك مكان ژني در يك چاهك الكتروفورز باشد (18).

7-7-1- كاربردهاي نشانگرهاي SSR

امروزه ريزماهواره‌ها به علت تعداد زياد و پراكنش اين توالي‌ها در ژنوم، يكي از نشانگرهاي مولكولي مفيد و سودمند در گونه‌هاي گياهي مانند ذرت، سويا، براسيكاسه، برنج، جو، ارزن، گوجه، سورگوم و انواع درختان ميوه مانند سيب مي‌باشند (14).  مهمترين كاربرد   ريز ماهواره‌ها شامل مطالعه تنوع ژنتيكي و تكامل (10)، تهيه نقشه‌هاي ژنتيكي، مطالعات اكولوژيكي و تكامل جمعيت‌ها و گزينش به كمك نشانگر مي‌باشد   .(19)

8-7-1- مزاياي ریز ماهواره ها

1) فراواني در ژنوم و سطح بالاي تنوع آللي در مكان‌هاي ريزماهواره

2) توزيع تصادفي در سراسر ژنوم

3) توارث هم بارز

4) از آنجا كه هر نشانگر ريز ماهواره به منزله يك مکان ژني می باشد، بنابراين هر نوار، يك مكان ژني به حساب مي‌آيد.  از اين خاصيت در مطالعات تكاملي و ژنتيك جمعيت و تجزيه‌هاي ژنتيكي بهره گیری مي‌گردد.  همچنين برآورد اندازه آلل‌ها در يك مكان به كمك مدلهاي رگرسيوني و نيز فراواني آللي امكان‌پذير مي‌باشد(30,27,20 ,22, 23).

5)تکرار پذیری بالا بدلیل طول نسبتاً زياد آغازگرهاي ريزماهواره (25-15 نوكلئوتيدي) و اختصاصي بودن جايگاه اتصال آنها

6) با در نظر داشتن اينكه توالي‌هاي احاطه كننده واحدهاي تكراري در داخل گونه و حتي در گونه‌هاي داخلي جنس‌ها، حفظ شده‌اند، بنابراين اين نشانگرها از اهميت خاصي در مطالعات اكولوژيكي و فيلوژنتيكي برخوردارندو همچنين آغازگرهاي طراحي شده براي يك گونه قابل بهره گیری در گونه‌هاي خويشاوند هستند (24, 14,10)

7) در اين نشانگرها، مشكل همولوگ بودن نوارهاي هم اندازه كه در نشانگرهاي RAPD و AFLP اتفاق مي‌افتد، وجود ندارد (21).

8) اگرچه هزينه بهره گیری از اين نوع نشانگرها زياد می باشد ولي به واسطه پتانسيل بالاي آنها در تشخيص پلي‌مورفيسم و هتروزيگويستي، به فراواني بهره گیری ميشود (17).

9) در SSR نيز مانند نشانگرهاي AFLP مي‌توان از فرآيند چند تركيبي بهره برد. بدين ترتيب که تكثير همزمان مكانهاي ژني چندگانه در يك PCR صورت مي‌گيرد. چند تركيبي همچنين مي‌تواند به صورت تركيب قطعات آللي بيش از يك مكان ژني در يك چاهك الكتروفورز باشد (18).

9-7-1- معايب ريز ماهواره‌ها

1) مشكل عمده ريزماهواره‌ها طراحي اوليه آغازگرهاي آنهاست كه بسيار پرهزينه و وقت‌گير می باشد. شناسايي و طراحي اوليه آغازگرها، نياز به شناسايي توالي‌هاي تكراري در كروموزوم‌ها و توالي‌هاي احاطه‌كننده آنها و در نهايت توالي‌يابي دارد. از اينرو در گياهاني كه روي آنها كار نشده   می باشد، بسيار هزينه‌بر مي‌باشد   .(25,  26)

2) گاهاً ممكن می باشد به علت تكرار بيش از يك بار يك مكان خاص در ژنوم، امكان امتيازدهي همبارز الگوي نواري وجود نداشته باشد.

3) به علت ظهور نوارهاي Stutter كه به دليل سرخوردن[3] آنزيم Tag پليمراز در هنگام تكثير صورت مي‌گيرد، امتيازدهي نوارها و همچنين تشخيص هموزيگوت‌ها از هتروزيگوت‌ها مشكل مي‌باشد.

شما می توانید مطالب مشابه این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید                     

4) وجود آلل‌هاي خنثي[4] پديده متداول در نشانگرهاي ريزماهواره می باشد كه علت آن هنوز به روشني مشخص نشده می باشد. اما نظريه‌اي در اين ارتباط ارائه شده كه اين پديده را ناشي از جهش در توالي‌هاي احاطه‌كننده جايگاههاي ريزماهواره مي‌داند (27, 28). در واقع آلل‌هاي خنثي به حالتي اطلاق مي‌گردد كه براي فرد موردنظر نواري در مكان مورد آزمون نظاره نگردد. اين پديده خصوصاً در تشخيص افراد هتروزيگوت يا دگر بارور گمراه‌كننده می باشد .(29, 14)

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را در شماره بندی انتهای صفحه بخوانید              

10-7-1- اساس چند شكلي در جايگاههاي ريزماهواره

مطالعات نشان داده‌اند كه شدت جهش در DNA هاي تكراري به مراتب بيشتر از  DNAهاي غيرتكراري می باشد (31). طي برآوردهاي انجام شده مشخص گرديده می باشد كه شدت جهش در ريزماهواره‌ها معادل جانشيني 10000-100 جفت باز مي‌باشد. اين باعث مي گردد كه ريزماهواره‌ها براي مطالعات تكاملي در مدت زمان كوتاه (1000-100 سال) مفيد باشند در حاليكه كه جانشيني جفت‌بازها براي مطالعات تكاملي در مدت زمان طولاني (ميليون سال) مفيدند. اين جهش‌ها عموماً در تعداد واحدهاي تكرارشونده اتفاق مي‌افتند. به همين علت تنوع يا چند شكلي در جايگاههاي ريزماهواره فراوان می باشد (32). دو نظریه در مورد چگونگی تغییرات ریز ماهواره ها هست

1-10-7-1-  مدل کراسینگ اور نا متقارن[5](UCO)

این مدل نا پایداری در ریزماهواره ها را به علت نرخ بالای کراسینگ اورهای نا متقارن در

تکرارهای ریزماهواره می داند.  کراسینگ اورهای نا متقارن نتیجه ای از نوترکیبی بین کرومزومهای شبیه به هم[6] می باشد که به صورت ناقص به صف شده اند.  این مدل پیشنهاد می کند که  کراسینگ اورهای نا متقارن در ریزماهواره ها در نرخ بالایی رخ می دهد. زیرا حضور تکرارها احتمال به صف شدن به گونه ناقص را بین کروموزومهای مشابه افزایش  می دهد (54).

2-10-7-1- مدل سر خوردن پلیمراز هنگام همانند سازی(SSM)

فرایند SSM اولین بار برای توضیح موتاسیونهای تغییر چهار چوب در هر نوعی از DNA ارائه گردید (51).در این لغزیدن DNA پلیمراز در هنگام همانند سازی موجب جدا شدن رشته الگو و رشته در حال سنتز به گونه موقت می گردد.  برای ادامه همانند سازی رشته ها بایستی دو مرتبه کنار هم قرارگیرند.  حال اگر رشته ها به صورت ناقص در کنار هم جفت شوند، موتاسیون رخ می دهد. در مناطق ریزماهواره زیرا تکرارها به آسانی می توانند به صورت لوپ از  DNA دو رشته ای خارج شوند، این پدیده بیشتر اتفاق می افتد (52).

8-1- واكنش زنجيره اي پليمراز

در واكنشPCR ، DNA در شرايط آزمايشگاهي كپي برداري مي گردد و عناصر اساسي فر ايند همانند سازي  DNAدر حاات طبيعي مورد بهره گیری قرار مي گيرند. در سلول زنده فرايند همانند سازي بسيار پيچيده می باشد و آنزيمـها و پروتئيـن هاي زيادي در كپـي برداري از ژنوم دخـيل  اند، ا ما PCR تنها اجزاء اصلي اين ماشين همانند سازي پيچيده را براي تكثير قطعات كوتاه DNA در لوله آزمايش مورد بهره گیری قرار مي دهد .

1-8-1- اجزای واکنش PCR

1-1-8-1- آنزیم

آنزيمDNA  Taq [7] پليمراز رايج ترين آنزيم مورد بهره گیری در PCR می باشد. كه از نوعي مايكو باكتريوم[8] گرما دوست به نام aquaticus thermus  بدست مي آيد، درجه حرارت مناسب براي فعاليت اين آنزيم بسته به DNA الگو ،80-75 درجه سانتي گراد می باشد كه اختصاصي بودن واكنش را افزايش مي دهد (18).

2-1-8-1-مخلوط ذروكسي نوكلئوتيد تري فسفات ( dNTPs )

dNTP با خلوص بالا بصورت 4 محلول پايه منفرد (هر كدام شامل تنها يك نوع dNTP ) و يا بصورت يك مخلوط از چهار نوع dNTP تهيه می گردد.  در غلظتهاي پايين dNTP (10 تا 100 ميكرومولار) DNA Taq پليمراز عملكرد بالايي دارد ولي در شرايط عادي نيز انجام PCR باغلظت حدود 100 ميكرومول قابل انجام مي باشد. غلظت مناسب dNTP در واكنش تكثير به عوامل متعددي مانند غلظت MgCl2  ، غلظت آغازگر ها[9] ، تعداد سيكلهاي PCR ، طول محصولات تكثير يافته و رقت واكنش بستگي دارد (33).

3-1-8-1-  DNA الگو

معمولاً DNA  الگو توسط محققين تهيه مي گردد. DNA ممكن می باشد دو رشته و يا تك رشته باشد اندازه ملكول DNA فاكتور مهمي در انجام PCR محسوب نمي گردد.  ولي هنگامي كه ازDNA ژنومي با وزن ملكولي بسيار بالا بهره گیری مي گردد، بهتر می باشد قبل از تكثير، DNA با آنزيمهاي برشي هضم گردد تا واكنش تكثير بهتر صورت بگيرد (34).

4-1-8-1-  آغازگرها

آغازگرها بر روي رشته الگو به تواليهاي مكمل وصل مي شوند و حدود محصولات تكثير را مشخص    مي كنند.  طول آغازگرها مانند عوامـلي می باشد كه در طـراحي آغازگر مورد توجه قـرار مي گيرد. با افزايش طول آغازگر ميزان اختصاصي بودن فراورده هاي PCR نيز افزايش مي يابد. آغازگرهاي جفت بايد به گونه اي طراحي شوند كه انتهاي OH ‘ 3 آنها مكمل نباشند،تا احتمال تشكيل دايمرهاي[10]           آغازگر – آغازگر كاهش يابد.  آغاز گرها بايد از تعداد تقريباً برابر از هر 4 باز ساخته شده باشند و در طراحي آنها از نواحي باتواليهاي غير معمول اجتناب گردد.   محتواي GC در پايداري هيبريد آغازگر- الگو مؤثر می باشد. يك آغازگر بايد داراي تعداد تقريباً مساوي از هر نو كلئوتيد باشد.  آغازگر ها نبايد ساختار ثانويه تشكيل دهند و دو انتهای آنها نبايد مكمل باشند (33و35).

5-1-8-1- بافرها و كلريد منیزيوم

معمولترين بافر مورد بهره گیری براي فعاليت آنزيمTaq DNA  پلميراز، داراي تركيبات ,Trise-Hl ,Kcl ,MgCl2 Geletin می باشد.  در صورت بهره گیری از ساير آنزيمهاي پليمراز مقاوم به حرارت تركيبات بافر متفاوت خواهد بود. غلظت2 MgCl در مخلوط نهايي واكنش مي تواند متغير باشد. معمولاً اين ميزان mM 5-5 /. (متناسب با نوع كار )  می باشد.  يون2+ Mg قادر می باشد با   dNTPها يك كمپلكس محلول تشكيل دهد كه براي عملکرد كردن dNTp ضروري می باشد. اين يون همچنين فعاليت پليمرازي را تحريك مي كند و دماي ذوب DNA و واكنش متقابل پرايمر/ الگو را افزايش مي دهد.

2-8-1- عوامل مؤثر براختصاصي بودن واكنش PCR

مهمترين پارامترهايي كه بر اختصاصي بودن واكنش مؤثرند شامل موارد زير می باشد:

1-2-8-1- غلظت مخلوط  PCR

غلظت مناسب  يون منیزیوم ، آغاز گرها، dNTP و آنزيم Taq DNA پليمراز در اختصاصي بودن واكنش مؤثر می باشد، غلظت MgCl داراي اثرات عميقي بر روي ويژگي محصول PCR می باشد. بطور معمول ، مقدار كم   MgClمنجر   به محصول كم و+2 Mg اضـافي منجربه جمع شدن محـصول غيـر اختصاصـي مي گردد ( ,33 19).  غلظت dNTP و+2 Mg بايد همزمان تغيير كند. از طرفي يونهاي آمونيوم و پتاسيم اثر متضادي بر PCR دارند. تشكيل باندهاي ضعيف همچنين مي تواند ناشي از پايين بودن غلظت آنزيم باشد.

2-2-8-1- دما

الف) دماي واسرشت سازي : اگر اولين مرحله واسرشت سازي بطور مؤثر انجام نشود، ملكولهاي دو رشته به سرعت بهم متصل مي شوند و مانع اتصال مؤثر آغاز گر و بسط  DNAخواهند گردید.  براي الگوهاي غني از GC ، افزايش دما در اين مرحله ممكن می باشد ضروري باشد.

ب) دماي اتصال : بازدهي و اختصاصي بودن هر واكنش PCR به اختصاصي بودن هيبريداسيون آغازگر به مكان هدف بستگي دارد.  عموماً دماي بالاتر در اين مرحله اتصال منجر به اختصاصي شدن اتصال آغازگر به الگوي هدف مي گردد. دماي پايين تر اتصالات اشتباهي بيشتري بين الگو و  آغاز گر ايجاد مي كند و منجر به افزايش تكثير تواليهاي غير هدف مي گردد.

3-2-8-1- تعداد و طول سيكل

عموماً تعداد سيكلها بايد تا حد ممينيم جهت توليد محصول كافي و مناسب نگهداري گردد.  مدت زمان انتقال از دماهاي مختلف فاكتور مهم ديگري می باشد عموماً انتقال سريعتر اختصاصي بودن واكنش را افزايش مي دهد (36).

4-2-8-1- افزاينده هاي PCR

تركيبات و افزاينده هاي متعددي بر اختصاص بودن يا بازدهي PCR مؤثر هستند كه دماي اتصال مؤثر واكنش را افزايش مي دهند . اين عوامل اتصال اختصاصي آغازگر به الگو را افزايش مي دهند و در اين صورت عملكرد و طول محصول را بهبود مي بخشند (35 ).

این نوشته در مهندسی کشاورزی - دامپروری ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

پاسخی بگذارید